鸡大肠杆菌病是致病性大肠杆菌引起的一种细菌性传染病，幼禽最易感，一年四季均可发生，对养鸡业危害极大[1]。该病临床表现复杂多样，常见的有急性败血症、气囊炎、肠炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、大肠杆菌脑炎和全眼球炎等病型，可单独发病，也容易继发感染，发病率、病死率均较高，治疗不及时可造成严重经济损失。大肠杆菌血清型较多，不同血清型之间缺乏交叉免疫保护，且不同地区的流行血清型存在一定差异[2]。不同血清型对药物的敏感性不一致，且耐药性日趋严重，很多临床常用的抗生素已失去治疗作用，临床防治愈发困难。本试验对泰州地区的发病鸡群进行了大肠杆菌血清型、毒力及耐药性调查，以期为该病防治提供流行病学和临床用药等方面的参考。1材料与方法1.1试验材料麦康凯培养基、营养琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司），微量生化鉴定管、药敏片（杭州微生物试剂有限公司），大肠杆菌Ｏ抗原单因子血清（中国兽医药品监察所）。1.2样品采集及细菌分离培养本实验室于2020—2021年，从泰州地区21个发生大肠杆菌病的鸡场选取162只病死鸡，无菌采集病料心、肝，接种于麦康凯培养基，37 ℃恒温培养24 h。选取光滑圆整的单个典型菌落纯培养，4 ℃冰箱保存。挑取纯化培养的菌落，抹片后进行革兰氏染色，镜检。1.3生化试验将纯化培养后的细菌接种于肉汤培养基，37 ℃培养24 h，按照文献[3]的方法接种到糖发酵、VP、MR、H2S、吲哚等12种微量生化鉴定管，进行生化指标测定。1.4血清型鉴定挑取纯化的菌落接种于营养琼脂斜面，37 ℃培养24 h，2 mL石炭酸生理盐水对营养琼脂斜面培养物进行冲洗，用小试管收集，121 ℃高压2 h，破坏其K抗原。用2只微量滴管分别吸取诊断血清和待测菌液各一滴，滴于洁净的载玻片，立即混匀，3 min内出现明显凝集颗粒判为阳性。1.5致病性测定将123只10日龄健康雏鸡随机分为41组，每组3只。营养琼脂斜面上纯化后的菌落用生理盐水冲洗，倾注平板培养法计算活菌数，调整细菌浓度为2×108 CFU/mL，在试验组鸡的颈部接种细菌悬液0.2 mL，对照组每只鸡接种生理盐水0.2 mL。接种后隔离饲养，记录发病及死亡情况。接种后第7 d剖检所有试验鸡，采集病料，分离病原菌并鉴定。引起50%及以上雏鸡死亡的菌株为高致病性，引起50%以下雏鸡死亡的菌株为中致病性，不引起死亡为低致病性菌株[4]。1.6药敏试验选取6大类14种抗菌药，参照K-B法[5]，无菌操作将已经鉴定为鸡大肠杆菌的培养物均匀涂布在营养琼脂培养基表面，间隔一定距离贴药敏试纸片，于37 ℃恒温箱培养18 h，测量药敏片的抑菌圈直径。2结果与分析2.1大肠杆菌分离鉴定结果（见图1、图2、表1）根据病死鸡的临床症状、病理变化，通过麦康凯培养基的培养筛选及生化鉴定，共从162份样品中分离到大肠杆菌65株。由图1、图2可知，大肠杆菌在麦康凯培养基上生长良好，粉红色菌落呈边缘整齐的扁平圆形，表面湿润光滑。挑取单个菌落革兰氏染色镜检，见两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌，符合大肠杆菌的形态特征。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.015.F001图1大肠杆菌培养形态Fig.1Culture morphology of E.coliXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.015.F002图2大肠杆菌镜检形态Fig.2Microscopic morphology of E.coli将分离的65株大肠杆菌进行生化试验鉴定，结果见见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.015.T001表165株大肠杆菌生化鉴定结果Tab.1Biochemical identification results of 65 strains E. coli项目阳性反应数/株阳性反应率/%项目阳性反应数/株阳性反应率/%葡萄糖65100V-P00乳糖65100MＲ65100麦芽糖65100H2S00蔗糖5991吲哚65100果糖65100尿素00甘露醇65100枸橼酸盐00由表1可知，65株大肠杆菌均能够发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖、甘露醇产酸产氧，部分发酵蔗糖；均无法利用枸橼酸盐，MR试验呈阳性，V-P试验、硫化氢呈阴性；结果与大肠杆菌特征相符。2.2大肠杆菌血清型鉴定结果（见表2）由表2可知，9株未能定型，定型菌株共56株。其中15株Ｏ78，占比23%；10株Ｏ1，占比15%；8株Ｏ18占比12%；6株Ｏ88占比12%；4株Ｏ2，占比6%；3株Ｏ5，占比5%；Ｏ35、Ｏ8、Ｏ13占各2株，Ｏ39、Ｏ81、Ｏ114、Ｏ126占各1株。表明泰州地区流行的鸡大肠杆菌优势血清型主要为Ｏ78、Ｏ1、Ｏ18、Ｏ88。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.015.T002表2大肠杆菌血清型鉴定结果Tab.2Serotype identification results of E.coli项目分离菌株数/株占比/%项目分离菌株数/株占比/%Ｏ781523Ｏ823Ｏ11015Ｏ1323Ｏ18812Ｏ3912Ｏ8869Ｏ8112Ｏ246Ｏ11412Ｏ535Ｏ12612Ｏ3523未定型9142.3大肠杆菌致病性试验结果（见表3）选取了41株主要血清型菌株进行致病性试验，结果见表3。接种致病性大肠杆菌1 d后，雏鸡出现精神沉郁、采食减少、腹泻等症状，部分雏鸡陆续死亡，剖检主要为肝脾肿大、心包积液等病变。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.015.T003表3大肠杆菌致病性试验结果Tab.3Pathogenicity test results of E.coli项目测试数高致病数中致病数低致病数合计412579Ｏ7810721Ｏ110613Ｏ188422Ｏ886312Ｏ24310Ｏ53201株由表3可知，41株测试菌中高致病性菌株25株，占61.0%；中致病性菌株7株，占17.1%；低致病性菌株9株，占22.0%。结果表明，大部分菌株具有很强的致病性，另外不同血清型菌株的致病性有所不同，相同血清型不同菌株的致病性也存在一定差异，其中Ｏ2和Ｏ78血清型菌株致病性最强。2.4大肠杆菌药敏试验结果（见表4）由表4可知，65株大肠杆菌对多西环素、红霉素全部耐药，对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、新霉素耐药率50%以上。敏感性最高的是阿米卡星，为87.7%，其次是头孢噻呋，为67.7%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.015.T004表4大肠杆菌药物敏试验结果Tab.4Drug sensitivity test results of E.coli项目高敏率中介率耐药率阿莫西林024.675.4氨苄西林1.546.252.3头孢噻呋67.723.19.2头孢曲松63.126.210.8庆大霉素038.561.5卡那霉素33.830.835.4新霉素6.232.361.5阿米卡星87.712.30多西环素00100.0氟苯尼考47.724.627.7红霉素00100.0替米考星64.620.015.4环丙沙星50.813.835.4恩诺沙星35.435.429.2%3讨论本研究从泰州地区的鸡场中共分离鉴定出致病性大肠杆菌65株，未定型菌株有9株。56个定型分离株共覆盖13个Ｏ血清型，其中血清型以Ｏ78、Ｏ1、Ｏ18、Ｏ88为主，与国内其他研究报道相比存在一定差异[6-9]，血清型占比的差异性可能与采样的时间、地区和养殖场具有一定关系。Ｏ78和Ｏ1作为优势血清型成员，本研究结果与大多数调查结果基本一致，表明Ｏ78和Ｏ1血清型菌株在各地流行情况较为严重，应引起广泛重视。Ｏ18和Ｏ88血清型菌株占比增加，表明其在本地区流行日益严重。41株测试菌中具有中、高致病性菌株共32株，占78.0%，表明当地流行的大部分致病性大肠杆菌菌株毒力较强，鸡群一旦感染可能会引起较大经济损失。药敏试验结果显示，发病鸡场的大肠杆菌已对大部分抗菌药产生耐药性，多西环素、红霉素耐药率100%，阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、新霉素耐药率50%以上，表明该地区大肠杆菌多重耐药问题已经非常严重，临床上应避免使用此类药物。大肠杆菌耐药能力与其血清型无直接关联，主要是由于一种或多种抗生素大量持续使用而产生[10]。上述抗菌药大多价格低廉且给药方便，养殖场更愿意购买，使用率高，耐药严重可能与这些因素有关。邵志勇等[11]对武汉地区55株禽大肠杆菌进行药敏试验，多重耐药率高达94.55%。李蕴玉等[12]对秦皇岛地区20株鸡大肠杆菌进行药敏试验，4重以上耐药菌株占100%。李娟娟等[13]对渭南地区26株致病性大肠杆菌进行药敏试验，结果显示对阿莫西林、复方新诺明、四环素、链霉素、多黏菌素和恩诺沙星等药物的耐药性较强。王欣宇等[14]药敏试验结果显示，长春地区鸡源大肠杆菌对青霉素、氧氟沙星等多种抗生素产生多重耐药性。唐标等[15]调查显示，大肠杆菌对四环素和氨苄西林耐药率最高。本研究中敏感性最高的是阿米卡星和头孢噻呋，但这两种抗菌药需要注射使用，给药不方便，敏感性高可能与药物临床使用率低有一定关系。一些重症病例食欲废绝，无法从饲料或饮水中摄入足够药物，可考虑注射阿米卡星或头孢噻呋提高治愈率。鸡大肠杆菌病具有高发病率的特点，不同季节、不同地区、不同品种和不同龄期的鸡群中均有发生。该病发病率和病死率与当地流行的血清型及菌株的毒力、有无并发或继发感染、采取措施是否及时有效等密切相关，且流行菌株和耐药性处于动态变化中。因此，该病防控和治疗方案应根据调查结果不断调整，一旦发病应迅速作出正确诊断，具有针对性地选择高敏药物，合理安排给药剂量和疗程，快速控制感染，以减少耐药性产生。4结论本研究结果表明，泰州地区鸡源大肠杆菌优势血清型为Ｏ78（23%）、Ｏ1（15%）、Ｏ18（12%）、Ｏ88（9%），其中Ｏ2和Ｏ78血清型菌株致病性最强。鸡场大肠杆菌多重耐药问题已经非常严重，多西环素、红霉素耐药率100%，阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、新霉素耐药率50%以上。敏感性最高的是阿米卡星，为87.7%，其次是头孢噻呋，为67.7%，临床治疗可以优先选用上述两种药物。