布鲁氏杆菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁氏杆菌（Brucella）引起的一种变态反应性人畜共患传染病[1]，我国将其列为二类动物疫病，卫计委将其列为乙类传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病[2]。布鲁氏杆菌宿主广泛，能够感染多种动物，严重危害了人类和动物的健康[3]。因此，有效防治布病对于保障公共卫生安全具有重要意义，而快速、准确的检测方法是防治该病和减少传播的关键[4]。布病常用的血清学检测方法包括平板凝集试验、虎红平板凝集试验（RBPT）、试管凝集试验、补体结合试验和间接酶联免疫吸附试验等[5]。其中传统试管凝集试验（SAT）以其特异性和敏感性用以布病的确诊，是我国法定的布鲁氏杆菌诊断的正式试验之一[6-8]。然而由于活畜交易频度、数量的增加和检疫、监测过程中样本数量庞大，导致进行大量样本检测时费时、费力，此外，为有效消除人为因素对试验结果的干扰影响，提高试验结果的真实性和科学性，需找到适合不同要求的检测方法[9]。本试验待检血清首先采用RBPT进行初次筛选，筛选出的阳性血清样品再分别通过SAT和微量凝集试验（MAT）进行最终定性，同时运用比浊对照法和酶标仪检测法进行结果判定。通过比较研究，以期寻找适合不同检验需求的快速、特异、敏感、简易及便于推广应用的布病诊断方法。1材料与方法1.1试验材料1.1.1待检血清待检样品均采集自浙江省某县2019年12月至2021年12月监测过程中。样品分别为山羊尾静脉或颈静脉血样5~10 mL，共750份。4 ℃静置过夜后，5 000 r/min离心5 min，吸取上清，于-20 ℃保存。1.1.2标准血清布鲁氏菌试管凝集试验阳性血清（批号：010062001）、布鲁氏菌试管凝集试验阴性血清（批号010051904）均购自青岛立见诊断技术发展中心。1.2试验方法1.2.1RBPT在洁净的玻片或玻璃板上用蜡笔划出4 cm2方格，方格中滴加30 μL待检血清，再将30 μL布鲁氏杆菌病虎红平板凝集抗原加入血清，充分混合，并同时设阳性和阴性对照。在20 ℃室温条件下，5 min内观察结果，出现肉眼可见凝集现象，判定为阳性；无凝集现象，呈均匀粉红色，则判定为阴性。1.2.2SAT每份被检血清分别准备6支小试管，在相应的1号管中分别加入2 300 μL稀释液，第2管不加，第3管、第4管、第5管、第6管各加入稀释液500 μL。吸取待检血清200 μL加入第1管，混匀后分别取500 μL加入第2管和第3管，第3管混匀取500 μL依次移入第4管，以此类推至第6管，最后第6管混匀后弃去500 μL。此时的血清稀释倍数从第2管开始到第6管分别为1∶12.5、1∶25.0、1∶50.0、1∶100.0、1∶200.0。除每组第1管外，第2管~第6管分别加入500 μL布鲁氏菌试管凝集工作抗原，每管反应体积均为1 000 μL。同时设置阴性血清对照和阳性血清对照，按常规配制好比浊管[10]，振荡混匀，置于37 ℃作用24 h，取出观察并记录结果，并在各管中吸取100 μL，置酶标板的相应孔中，轻摇混匀，在酶标仪上读取OD450nm值。1.2.3MAT取96孔一次性U型反应板，每1列为1份样本。按编号在A1~A12孔加入稀释液239.2 μL，其余各孔加入130 μL。分别将待检血清20.8 μL加入A1~A12行各孔中，混匀后取130 μL加入第2行的相应各孔，按照上述步骤依次进行第3行和第4行的混合稀释，待第5行混匀后弃去130 μL，使血清稀释倍数为1∶12.5、1∶25.0、1∶50.0、1∶100.0、1∶200.0。各孔再加入130 μL布鲁氏菌试管凝集工作抗原，每管反应总量为260 μL，第6行以反应总量260 μL为基数，按比例配制各比浊对照法，第7行做抗原及阴性对照。振荡混匀，置湿盒于恒温箱中37 ℃作用24 h，取出观察并记录结果，并取各孔100 μL至空白酶标板的相应孔，轻摇混匀，在酶标仪上读取OD450nm值。1.2.4观察指标与结果判定本研究分别采用比浊对照法以及酶标仪读数法进行检测结果的判定，并通过统计学方法对两种判定结果的一致性进行分析。（1）比浊对照法的结果判定。依据以试验配制比浊管为准，结果呈“++”为血清凝集最高稀释度，阳性：1∶50（++）及以上；可疑：1∶25（++）。（2）酶标仪读数法。以比浊管的OD值作为临界值，样本OD值小于或者等于临界OD值判定为阳性，否则判定为阴性。1.3数据统计与分析试验数据采用Excel 2013软件进行统计、整理，SPSS 22.0统计学软件进行分析，t值检验进行两组间比较，χ2检验计数资料组间率。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1待检血清经RBPT初筛结果由于RBPT具有操作方法简便、快速、灵敏度高等优点，适用于布病的初筛试验。初筛结果显示，750份待检血清中检出阳性样品98份，阳性率为13.06%。2.2SAT、MAT与RBPT的检测结果比较（见表1）由表1可知，经RBPT初筛为阳性98份血清样品，通过SAT检测，经酶标仪读数法判定阳性数93份，与RBPT的阳性符合率为94.9%；通过MAT检测，经酶标仪读数法判定阳性数95份，与RBPT的阳性符合率为96.9%。二者的阳性检出率与RBPT的阳性检出率比较差异均不显著（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.013.T001表1SAT、MAT与RBPT的检测结果比较Tab.1Comparison of diagnostic performance of SAT, MAT and RBPT项目RBPT阳性阴性合计SAT阳性93093阴性505合计98098MAT阳性95095阴性303合计98098份2.3SAT与MAT检测结果的比较分析（见图1）98份待检样品中，通过SAT检测，经酶标仪读数法显示阳性数为93份，而通过MAT检测，经酶标仪读数法显示阳性数为95份，两种检测方法的准确度无显著差异（P0.05）。MAT法由于使用微量移液器代替吸管，同时改良加样方案，使加液和加样更加精确，从而减小了误差。由图1可知，与SAT方法相比，MAT的稳定性及检出率更好，试验结果显示提高阳性检出率达3%左右。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.013.F001图1SAT与MAT检测结果的比较分析Fig.1Comparative analysis of SAT and MAT test results2.4酶标仪读数法和比浊对照法对检测结果的影响分析（见表2）本研究采用酶标仪读数法和比浊对照法两种不同的判定方法分别对SAT和MAT的检测结果进行判定。由表2可知：在SAT试验中，两种结果判定方法的阴性符合率为100.0%，阳性符合率为92.5%，酶标仪读数法阳性93份，而比浊对照法阳性86份，可疑7份。而在MAT试验中，两种判定方法的阳性符合率为88.4%，酶标仪读数法阳性数为95份，而比浊对照法阳性84份，可疑11份；阴性符合率为100.0%，均为3份。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.013.T002表2酶标仪读数法和比浊对照法对检测结果的影响分析Tab.2Analysis of influence of microplate reader reading method and turbidimetric control method on test results项目结果判定方法阳性可疑阴性合计SAT酶标仪读数法930598比浊对照法867598MAT酶标仪读数法950398比浊对照法8411398个3讨论布鲁氏杆菌病作为人畜共患的一种传染病，传播范围广、传播速度快，且近年来疫情呈现回升趋势，严重危害了人和动物的健康，引起严重的公共卫生问题[11-12]。因此对该病的早期诊断和防治具有十分重要的意义。血清学检验是布鲁氏杆菌病诊断的常用方法，包括RBPT、SAT以及MAT等。RBPT针对免疫球蛋白G（IgG）类抗体进行检测，其操作简单、快速，可在短时间内定性分析出布鲁氏菌病感染结果，但容易受到非特异性抗体的干扰，进而显示假阳性结果。因此，RBPT适用于大范围初筛，后期还需加以确诊[13-16]。本研究对经RBPT初筛为阳性98份血清样品，分别通过SAT和MAT进行最终定性，结果显示：与RBPT相比，SAT和MAT检测的阳性符合率分别为94.9%和96.9%，表明SAT和MAT的特异度高于RBPT，与高玉芬等[17]的研究结果一致。二者比较，MAT的稳定性及检出率优于SAT，而且在大面积筛查时减少了烦琐的检测步骤。本研究还分别运用比浊对照法和酶标仪读数法对检测结果进行判定。由于比浊对照法的判定是通过肉眼观察比较浑浊度，受人为因素干扰易造成可疑结果，影响最终检测结果[18]。因而从判定的准确性、精准度以及灵敏度来看，酶标仪读数法更具有优势。而且酶标仪读数法还降低了劳动强度，提高工作效率，当检测数量较大时可显著提高检测效率。4结论本研究通过SAT和MAT对初筛布鲁氏杆菌阳性的血清进行最终定性，并分别运用比浊对照法和酶标仪读数法对检测结果进行判定。结果表明，MAT法更加精确，误差更小；酶标仪读数法在结果的判定上更具有优势。在临床诊断时二者可相结合进行综合判定，以提高准确性。本研究为进一步寻找快速、特异、敏感及便于推广应用的布鲁氏杆菌病诊断方法提供了参考，对布鲁氏菌杆菌的检测和诊断具有一定参考意义。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.013.F002