高水分玉米籽实湿贮技术的研究与应用在黑龙江省，尤其在黑龙江农垦区域的奶牛养殖科研与生产中已有近五十年的历史[1-3]。玉米湿贮技术是一种用于贮藏高湿优质玉米的湿贮技术，将收获后含水量25%~35%的玉米籽粒，经粉碎、压实并在湿贮窖中密封贮藏，通过玉米乳酸菌发酵后产生大量的乳酸，降低pH值，从而达到抑菌抗病、防腐防霉变的目的，并能够减少玉米营养物质损失[4-6]。玉米籽实湿贮技术可减少传统烘晒环节3%~5%贮存损失，节约干燥能源，降低贮藏费用。此外，湿贮后的玉米还具有抑菌防霉变的效果。然而，在牧场生产条件下，受玉米品种、种植条件、气象及制作和储存方式等外界因素影响，不同牧场的湿贮玉米品质及应用效果存在较大差异。因此，只有通过对湿贮玉米的营养品质及饲喂价值的全面科学评估，才能够更精准地指导牧场充分发挥湿贮玉米的营养和经济价值，提高经济效益[7]。湿贮玉米在牧场中使用仍尚停留在依据化学营养成分评估结合传统经验的阶段。体外发酵培养试验是通过采取反刍动物瘤胃液，利用体外发酵装置进行的体外仿生试验，具有操作简单、易于掌握、费用低且试验条件容易模拟、实用性强的特点，在反刍家畜饲料原料营养价值评估中广受认可和应用[8-10]。本试验通过体外发酵方式，对来源于同一地区的6个牧场的湿贮玉米开展了体外发酵的粗蛋白（CP）、干物质（DM）、中性洗涤纤维（NDF）降解率等代谢参数的测定，以期为湿贮玉米在牧场的科学精准利用提供参考。1材料与方法1.1试验仪器与试剂1.1.1主要仪器试验用仪器均由黑龙江八一农垦大学动物科技学院提供，包括DELTA320低温冷冻高速离心机（Thermo公司）、K1100F全自动凯氏定氮仪（FOSS公司）、T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、A220纤维分析仪（安卡姆公司）、DHG-9246A电热恒温干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）、JD100-3B型电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）、F2-Standard便携式酸度计（梅特勒公司）、HZQ-F100振荡培养箱（哈尔滨市东联医疗仪器厂）、DSHZ-600水浴恒温振荡器（苏州江东精密仪器有限公司）等。1.1.2主要试剂0.85%生理盐水、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、NaCl、MgSO4·7H2O、Na2CO3、EDTA、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、NiCl2·6H2O、NaMoO4、Na2S·9H2O；浓盐酸、水杨酸钠、氢氧化钠、亚硝基铁氰化钠、次氯酸钠溶液、硼酸、甲基红、溴甲基绿、无水乙醇、K2SO4、CuSO4、蔗糖USP、Na2EDTA、Na2B4O7·10H2O、C6H14O4；α-淀粉酶-热稳定细菌α-淀粉酶，Na2SO3、CH3COCH3。所有试验用试剂由黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室提供。1.2样品处理本试验研究不同牧场来源湿贮玉米的体外发酵参数的变化。样品由项目组在北大荒集团牡丹江分公司所属的6个集约化奶牛场湿贮玉米窖中采用九点采样法结合四分法最终采取约1.5 kg样品，编号为1号、2号、3号、4号、5号、6号，并迅速采用具有抽气孔的专用真空包装袋真空包装后带回实验室于冰柜中保存。体外发酵代谢试验前，将湿贮玉米样品于恒温烘干箱内进行65 ℃烘干24 h，烘干后用粉碎机粉碎分级过筛，分装到样品袋中置于-20 ℃冰箱内保存。1.3缓冲液配制缓冲液制备参照任莹等[10]方法配制。1.4瘤胃液采集试验前一周每天8:00和17:00饲喂装有瘤胃瘘管羊，自由饮水。试验当天饲喂前2 h采集瘤胃液，混合后置于提前充满CO2的且已经预热至39 ℃保温瓶中，采集后立即将瓶口盖严，迅速返回实验室。用4层纱布将瘤胃液过滤，过程中应持续通入CO2。过滤后的瘤胃液需用便携式酸度计快速测定pH值，容器内始终保持无氧环境。1.5体外发酵培养试验当天对培养瓶进行标号，6个样品均设5个重复，分别准确称量3 g左右样品于5个培养瓶内，每个样品组再加设一个不添加湿贮玉米样品的空白试验组。称量完成后，量取40 mL缓冲液分装至所有培养瓶内，持续通入CO2 10 min,使瓶内变成无氧环境，关闭三通阀，置于39 ℃恒温水浴摇床中，每个培养瓶加20 mL瘤胃液。分装过程在厌氧条件下进行，分装完成后打开三通阀，培养瓶和注射器保持联通，恒温水浴摇床100 r/min振荡12 h。1.6测定指标及方法测定原始6个样品及经过12 h体外发酵培养后各样品底物的CP、DM、NDF含量，计算降解率。利用全自动凯氏定氮仪按照GB/T 6432—2018方法测定CP；按照GB/T 6435—2014方法测定DM；使用纤维检测仪（安卡姆公司）按照GB/T 20806—2006测定NDF。体外发酵前的原始样品CP、DM、NDF测定采取4个平行样平均值作为各试验组初始数据，发酵后的CP、DM、NDF按试验设计重复样品检测。发酵后底物样品制备方法：将发酵12 h后的培养瓶中的缓冲液瘤胃液及消化后的底物残渣倒出，用4层纱布过滤，分离滤渣置于已知重量的干净的铝盒中并称重，然后放入105 ℃恒温烘干箱中烘干24 h，再称重。CP降解率=[1-（发酵后底物重×底物CP含量-空白组底物重×空白组底物CP含量）/（发酵前原始样品重×样品CP含量）]×100%(1)DM降解率=[1-（发酵后底物重×底物DM含量-空白组底物重×空白组底物DM含量）/（发酵前原始样品重×样品DM含量）]×100%(2)NDF降解率=[1-（发酵后底物重×底物NDF含量-空白组底物重×空白组底物NDF含量）/（发酵前原始样品重×样品NDF含量）]×100%(3)1.7数据统计与分析试验数据采用SPSS.23软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析不同牧场湿贮玉米CP、DM、NDF降解率测定结果见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.004.T001表1不同湿贮玉米体外发酵CP、DM、NDF降解率Tab.1Degradation rates of CP, DM and NDF in vitro fermentation of different wet-storage maize组别CPDMNDF1号45.61±0.87Aa31.65±13.3716.46±1.59Cd2号31.87±1.03Bb18.38±7.7436.12±2.60Bb3号24.29±1.42Dd21.30±10.2527.78±4.31Bc4号31.50±1.61Bb23.65±15.4133.48±4.03Bbc5号29.82±1.96Bb29.41±10.8547.87±8.62Aa6号27.33±2.20CDc17.80±13.3233.36±3.76Bbc注 ：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%由表1可知，6个牧场湿贮玉米CP降解率按照大小顺序排列为：124563，数据范围在24.29%~45.61%之间。其中1号极显著高于其余5组（P0.01）；2号与4号、5号间差异不显著（P0.05），极显著高于3号及6号（P0.01）；3号显著高于6号（P0.05）。由表1可知，6个牧场湿贮玉米体外发酵DM降解率的大小顺序排列为154326，数值范围在17.80%~31.65%之间，各牧场间DM降解率差异不显著（P0.05）。但具体数据相差较大，6号只有1号的56.24%。由表1可知，不同牧场NDF降解率按照大小顺序排列为：524631，数值范围在16.46%~47.87%之间。其中5号极显著高于其余5组（P0.01）；2号与4号、6号差异不显著（P0.05），显著高于3号（P0.05），极显著高于1号（P0.01）。1号极显著低于其他5组（P0.01）。3讨论经体外发酵，样品中营养物质的降解率能够在一定程度上反映饲料在体外发酵体系中被瘤胃中微生物所降解的程度，也是评价瘤胃发酵的重要指标之一。测定饲料中CP含量以及其他营养物质的降解率可为科学定制饲料配方提供依据[11]。本试验结果表明，6个牧场湿贮玉米CP降解率在24.29%~45.61%之间，存在较大差异。因此，对于不同牧场而言，其湿贮玉米在日粮中的使用量应根据其各自代谢参数科学配制，方可充分发挥湿贮玉米的品质特性。本试验中，各组DM降解率在15.16%~31.54%之间，与前人研究存在较大差距[12-14]。其主要原因可能是本试验的结果是12 h体外发酵的数据。本试验中，尽管各牧场间数据统计学上差异不显著，但数据依然呈现较大差异，6号牧场样品的DM降解率只有1号牧场的56.24%。日粮中NDF含量及NDF降解率是反刍动物干物质采食量（DMI）的最核心影响因子之一[15-16]。因此，对于占日粮能量来源50%以上比例的原料玉米的NDF含量及NDF降解率指标，在牧场实际生产中必须采用现场准确测定的数据，而非借用常规饲料营养价值表数据。湿贮玉米因收获时间、品种、气象、发酵剂添加与否、贮存方式等不同，其实际营养指标及发酵代谢规律均会产生较大差异。本试验结果显示，6个牧场样品的NDF的降解率在16.45%~47.88%之间，变异度较大，与庞鑫等[15]、王超等[16]的研究结论相似。4结论高水分湿贮玉米在不同集约化牧场的科学精准高效利用，既要关注常规化学营养成分指标，更要结合体外发酵方法或动物代谢方法测定瘤胃各代谢参数的指标，方可实现降低成本增加牧场经济效益的目标。本试验结果表明，同一地区的6个不同牧场湿贮玉米CP和NDF降解率存在极显著差异，DM降解率差异不显著。