目前，结核病依然是全球最重要的传染病之一，严重危害人和动物的身体健康。抗菌肽具有一定的抗结核分枝杆菌活性[1-3]，而哺乳防御素作为抗菌肽的重要组成部分，具有抵抗多种微生物，如细菌、病毒和真菌的能力[4-5]。本文主要总结哺乳动物防御素的种类和来源及其在结核病预防和治疗中的作用机制和应用效果，探讨防御素作为一种新型抗结核药物的潜在可能性，为其后续开发提供参考。1哺乳动物防御素种类及分布根据防御素的结构特点和抗菌活性，目前多将哺乳动物不同细胞表达的防御素分为三大类：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。1.1α-防御素α-防御素在兔肺泡巨噬细胞[6]中发现，在人类、猴子和部分啮齿类动物（如豚鼠、鼠）中均有表达，多存在于多形核中性粒细胞（PMNs）以及某些巨噬细胞和小肠潘氏细胞中[7]。人PMNs胞浆内的嗜天青颗粒中约30%蛋白质为人中性粒细胞α-防御素（HNPs）1~α-HNPs-4[8]：小肠的潘氏细胞和上皮细胞中则主要表达α-HNPs-5和α-HNPs-6[9]；兔的中性粒细胞中发现有6种α-防御素[10-11]；豚鼠的中性粒细胞中有GPDEF-1、GPDEF-2两种α-防御素[12]；小鼠小肠潘氏细胞内发现至少有19种α-防御素，又被称为隐窝素（cryptdins）[13]。1.2β-防御素与α-防御素不同，β-防御素则主要表达于人、鼠、牛、羊、猪、骆驼及鸡和火鸡的多种器官的上皮组织[14-15]。其中第一个β-防御素发现于牛舌组织中，随后在灵长类（人类和猿类）、牛和啮齿类动物（如大鼠和小鼠）中均发现了β-防御素家族成员[16]，而猪和其他农场动物则仅表达β-防御素[17]。猪β-防御素（PBD）基因在机体的各个组织中广泛表达，尤其是机体第1道防线组织（小肠和肺）及重要免疫器官（脾脏和胸腺）表达丰度比较高[18]；小鼠β-防御素有mBD-1~mBD-6[19]，大鼠β-防御素有rBD-1、rBD2[20]，均主要分布于肺、气管、肾脏和雄性生殖管道内；人β-防御素（HBDs）作为上皮屏障的一部分，在机体多个身体系统中均可表达，在对抗机体细菌感染中发挥重要作用[21-22]。1.3θ-防御素θ-防御素是唯一具有圆形结构的防御素亚科，最早发现于恒河猴的单核细胞和嗜中性粒细胞，是哺乳动物中数量最少的防御素亚科[23]。目前，关于θ-防御素分布和多样性的研究较少，仅在3种灵长类动物体内分离到11种不同的θ-防御素[24]。2哺乳动物防御素的抗分枝杆菌活性及作用机理肺结核患者的支气管肺泡灌洗液（BAL）样本和胸膜液样本中均可检测到高浓度表达的α-防御素，此外在禽结核分枝杆菌感染的患者支气管肺泡灌洗液中也检测到高水平表达的β-防御素[25]。上述结果表明，分枝杆菌感染后会引发机体防御素表达水平的变化。2.1α-防御素的抗分枝杆菌活性及作用机理体外试验研究表明，哺乳动物α-防御素具有抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和抗真菌的活性，且可以通过调整环境条件使其发挥不同作用，如使用氧化还原剂、调节pH值等[26]。有研究通过基因芯片技术，比较肺结核病患者和感染结核分枝杆菌但结核菌素皮肤测试阳性的健康个体的外周血单核细胞基因表达图谱，结果显示，肺结核病患者α-防御素1、α-防御素3和α-防御素4的表达量均上调[27]。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、实时荧光定量（qPCR）等方法分别检测肺结核患者和健康人外周血HNP1-3水平及外周血中性粒细胞HNP1-3的mRNA表达水平，结果发现，肺结核组外周血HNP1-3水平显著高于健康对照组，肺结核组中性粒细胞HNP1-3的mRNA表达为健康对照组的2.17倍[28]。体外试验结果也表明，5 g/mL HNP-1在适宜的pH值条件下可杀死胞内禽型分枝杆菌，HNP-2和HNP-3在体外杀死胞内禽型分枝杆菌的效果与HNP-1一致[29]。结核分枝杆菌感染后还可诱导小鼠体内嗜酸性粒细胞分泌α-防御素增多[30]，从而发挥抗分枝杆菌作用。由于HNPs自身具有增强机体免疫活性的效果，因此其在动物体内试验中所显示的抗分枝杆菌活性可能也与此有关，如通过趋化T细胞和单核细胞调控细胞因子分泌和炎性反应发生等。基于α-防御素在宿主免疫中的抗菌活性和功能，中性粒细胞-巨噬细胞协同参与清除机体内结核分枝杆菌的作用机制为：体外试验中，HNPs通过增加分枝杆菌细胞膜的通透性发挥显著的抗分枝杆菌活性；除直接的抗菌活性外，早期病灶中浸润的中性粒细胞所分泌的HNPs还可发挥趋化因子的作用，吸引免疫细胞，包括巨噬细胞、T淋巴细胞、肥大细胞和不成熟记忆T细胞；早期病灶中中性粒细胞释放的HNPs可以通过调节细胞因子的表达影响机体炎症反应，且巨噬细胞分泌的TNF-α也会通过介导防御素表达促进中性粒细胞的抗菌活性。2.2β-防御素的抗分枝杆菌活性及作用机理体外试验结果表明，与正常人源单核细胞-巨噬细胞相比，通过转染HBD-2基因可以改善巨噬细胞控制结核分枝杆菌生长的能力，尤其是对结核分枝杆菌H37Rv具有很强的抗菌活性[31]。除人β-防御素之外，牛和兔的β-防御素也具有相似或更有效的抗分枝杆菌活性，通过真核表达牛中性粒细胞β-防御素（BNBD）4[32]和BNBD-5[33]，体外与分枝杆菌互作后显示其具有较好的抗分枝杆菌活性，与巨噬细胞作用后可提高其细胞内杀菌能力[34-35]。在小鼠试验性肺结核感染中，感染早期小鼠气道上皮细胞表达的鼠β-防御素（mBD）3和mBD-4，可能参与暂时控制小鼠体内分枝杆菌生长[36]。潜伏性结核分枝杆菌感染期间，小鼠体内稳定高表达的mBD-4可能有效帮助长期控制分枝杆菌增殖。β-防御素抗分枝杆菌活性的作用机理为：HBD-1可以通过增加分枝杆菌的细胞壁和细胞膜通透性发挥抗分枝杆菌中作用，还可以增加结核杆菌体外感染内皮细胞中HBD-1的过表达，通过引发细胞骨架重排的方式实现其抗分枝杆菌活性[37]。BNBD-4和BNBD-5不仅可以直接破坏分枝杆菌的细胞壁发挥杀菌活性，还可作用于巨噬细胞，提升巨噬细胞的抗分枝杆菌能力[33]。也有研究发现，HBD-4可以通过启动感染巨噬细胞内先天免疫防御的白细胞介素-1β（IL-1β）和维生素D受体（VDR）信号通路，影响巨噬细胞内结核分枝杆菌存活[38]。2.3θ-防御素的抗分枝杆菌活性及作用机理θ-防御素具有天然结构，主要通过与细菌结合以及中和细菌毒素发挥抗菌活性[39]。但是目前尚无关于θ-防御素抗分枝杆菌作用的相关研究报道。因此，鉴于防御素的直接抗分枝杆菌活性以及其在分枝杆菌感染中的诱导表达结果，均表明提前给予防御素可以预防分枝杆菌感染，从而影响疾病发展，对机体产生有利影响，提示防御素作为一种新型的分枝杆菌感染预防性或者治疗性药物的潜在可能性。3哺乳动物防御素的抗分枝杆菌治疗作用及应用尽管尚未见到临床中关于防御素作为抗结核分枝杆菌药物的报道，但在结核分枝杆菌感染试验动物后给予防御素或联合抗结核药物使用后，对机体所产生影响的研究结果均显示出防御素可有效治疗分枝杆菌感染。3.1α-防御素的抗分枝杆菌治疗作用及应用研究中首先使用结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠，再给予小鼠一定剂量的HNP-1（1、5 µg/只），结果发现，HNP-1具有清除小鼠肺脏、肝脏和脾脏组织中细菌的作用，且具有明显的时间-剂量依赖性[40]。研究表明，人嗜酸性粒细胞释放的α-防御素也具有抗分枝杆菌感染保护作用，具体表现在结核分枝杆菌BCG脂多糖可刺激嗜酸性粒细胞分泌α-防御素，α-防御素与嗜酸性粒细胞阳离子蛋白发挥协同作用，抑制分枝杆菌生长[41]。早期研究认为，分枝杆菌耐药性的产生多与其细胞膜的特殊结构有关。但近几年研究表明，联合使用HNPs和抗结核药物可以同时增加结核分枝杆菌细胞壁和细胞膜的通透性，避免耐药菌产生，能够促使抗结核药物进入细胞内发挥靶向作用，实现治疗结核分枝杆菌H37Rv感染的作用[42]。因此，表明HNPs具有作为一种潜在的辅助药物，与传统抗结核药物共同使用发挥抗结核治疗作用的可能性。3.2β-防御素的抗分枝杆菌治疗作用及应用β-防御素除自身具有一定的抗结核分枝杆菌活性外，其与抗结核药物利福平联合使用能够显著影响结核分枝杆菌的生长[43]。此外，将β-防御素2基因转染至小鼠体内后再感染分枝杆菌，结果显示，转染后感染小鼠的存活率更高，且小鼠体内细菌载量也更低[44]。也有研究表明，在试验性鼠结核病中，通过诱导β-防御素表达可作为治疗结核病的新型免疫疗法[45]。研究表明，牛分枝杆菌BCG可诱导人上皮细胞表达HBD-2，在结核分枝杆菌感染时发挥保护作用[46]，且牛分枝杆菌BCG的细胞壁蛋白（18-30kDa）还能够刺激人肺泡上皮细胞表达防御素[47]。通过对机体加强免疫BCG疫苗，同时接种β-防御素2 DNA疫苗，结果显示，两者共用可增强机体的抗结核分枝杆菌免疫活性[48]。由于BCG对机体的保护作用已得到公认，因此，提示β-防御素可能在预防和治疗结核病的过程中发挥了重要作用。苏峰[49]通过纯化HBD3蛋白并验证HBD3蛋白对结核杆菌的抑制作用，构建HBD3真核表达载体，并利用体细胞核移植技术获得了转HBD3基因的转基因牛，以提高牛的抗结核能力。此外，也有研究使用真核表达的重组蛋白BNBD-5通过滴鼻给药的方式给予BCG免疫小鼠，结果发现，其在气管黏膜上皮能够发挥非特异性免疫诱导作用，促进肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-1β以及抗体免疫球蛋白A（IgA）的表达[50]，进而提高小鼠抗结核分枝感染的能力。3.3θ-防御素的抗分枝杆菌治疗作用及应用θ-防御素具有抗多种病原体活性，尤其是抗病毒活性，但目前仍无关于θ-防御素抗分枝杆菌作用及应用的相关报道。4结论哺乳动物防御素具有较好的抗分枝杆菌活性，其中α-防御素和β-防御素不仅可以直接作用于病原体，还可通过刺激机体天然免疫和适应性免疫，或与传统抗结核药物协同使用，发挥其抗分枝杆菌作用。因此，尽管目前在临床上关于防御素的抗结核治疗效果的研究较少，但不可忽视哺乳动物防御素所表现的巨大的临床应用潜力。