2016年全国奶牛粪污年产量约4亿t，奶牛粪污中除含有氮、磷及有机质等是农作物生长需要的养分外，还含有病原微生物、抗生素抗性基因素等污染因子。养殖过程中产生的粪污处理不当，会对水体、大气及土壤等造成污染，甚至对公共卫生构成潜在威胁，造成生物资源浪费[1-2]。因此，需要对奶牛粪污进行高效处理和资源化安全利用。好氧堆肥是畜禽粪污处理和资源化利用的重要手段，但由于堆肥物料中富含木质素，实际应用中存在堆肥周期长、高温持续时间短、木质素降解不彻底等问题[3-4]。奶牛粪污中含有大量难以被微生物降解的木质纤维素，严重制约了堆肥的腐熟。为提高粪污中木质纤维素的降解率，关于纤维素高效降解菌筛选的研究较多。周东兴等[5]从牛粪和玉米秸秆混合堆肥的腐熟物料中筛选出枯草芽孢杆菌和隐球酵母菌，在pH值6.5、30 ℃条件下培养48 h，羧甲基纤维素酶活分别为26.82、31.82 U/mL。武肖莎等[6]发现，牛粪秸秆堆肥过程中接种高温降解菌株BS40-4有利于物料快速升温，延长高温期持续时间。单建荣等[7]研究发现，堆肥过程中添加纤维素降解菌YSX-3，最高温度可达62.5 ℃，纤维素降解率45.2%。因此，在堆肥过程中添加耐高温纤维素降解菌可促进纤维素的有效降解。本研究以奶牛粪污异位发酵床高温期堆肥样品为菌源，50 ℃进行培养纯化，筛选优势菌株，对其进行滤纸条崩解能力和羧甲基纤维素酶测定，筛选耐高温且产酶能力佳的菌株，为开发耐高温、高效降解纤维素菌剂及奶牛粪污高效降解的优质菌源提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品来源试验样品为武汉市某奶牛场异位发酵床高温期（第5 d、≥50 ℃）堆肥物料。1.1.2试剂及仪器主要试剂：葡萄糖、微晶纤维素、DNS试剂、琼脂、NaCl和蛋白胨等（青岛高科技工业园海博生物科技有限公司），羧甲基纤维素钠、刚果红（上海麦克林生化科技有限公司），K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和牛肉膏（国药集团化学试剂有限公司），培养皿（江苏大唐医疗器械有限公司）、细菌及真菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）、细菌及真菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）。主要仪器：GI80DWS高压灭菌锅（致微（厦门）仪器有限公司）、QL-861涡旋混合仪（江苏海门其林贝尔公司）、SW-CJ-2FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、Neofuge15R高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）、HPS-300恒温培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、KYC-100B恒温摇床（上海新苗医疗器械有限公司）、ETC811PCR仪（苏州东胜兴业科学仪器有限公司）、细胞型1810A超纯水系统（重庆摩尔水处理设备有限公司）、MULTISKANMK3型酶标仪（Thermo）。1.1.3培养基刚果红培养基（1 L）：K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、CMC-Na 1.88 g、刚果红0.2 g、明胶2 g、琼脂20 g，pH值7.0。牛肉膏蛋白胨培养基（1 L）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20 g，pH值7.4~7.6。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）（1 L）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，自然pH值。高氏一号培养基（1 L）：可溶性淀粉20 g、KNO3 1 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0. 5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂20 g，pH值7.4~7.6（倒皿前每300 mL加入3%重铬酸钾溶液1 mL混匀，倒入无菌培养皿）。滤纸条培养基（1 L）：K2HPO4 1 g、(NH4)2SO4 3 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、酵母膏0.1 g、滤纸条（1 cm×6 cm）3条/瓶，pH值7.0。液体发酵产酶培养基（1 L）：CMC-Na 7.5 g、(NH4)2SO4 3 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、蛋白胨10 g、麸皮30 g。所有培养基均121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。1.2测定指标及方法1.2.1菌株的筛选称取5 g样品置于100 mL无菌水的三角瓶中，180 r/min、50 ℃恒温振荡培养30 min，制备样品混悬液。吸取1 mL混悬液加入装有100 mL含有CMC-Na富集培养基中，进行多次富集。取1 mL富集液稀释成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，再次吸取100 μL分别涂布于PDA、高氏一号和牛肉膏蛋白胨培养基平板上，50 ℃恒温培养。待平板上长出菌落1 d，挑选形态不同的单菌落进行分离纯化，将纯化好的菌株接种至刚果红培养基上，测定培养基上水解圈的直径（D）和菌落直径（d），并计算其比值（D/d）。将初选得到的菌株接种至液体培养基中，50 ℃恒温振荡培养，调节菌液OD值为0.6。在98 mL滤纸条培养基中接入2 mL菌液，50 ℃、80 r/min下培养10 d；空白组不接种菌液。每组3个重复，根据滤纸条的断裂崩解程度判断菌株的降解能力。1.2.2酶活力测定标准曲线的绘制：分别取葡萄糖标准液（1 g/L）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL试管中，分别准确加入DNS试剂1.5 mL，沸水浴加热5 min，流水冷却，使用蒸馏水补足至15 mL，540 nm波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制出标准曲线，葡萄糖标准曲线见图1。测定葡萄糖标准曲线为y=0.969x+0.030 7（R2=0.996 4）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.014.F001图1葡萄糖标准曲线粗酶液制备：在三角瓶中装入98 mL发酵产酶培养基，吸取2 mL菌液接种至发酵产酶培养基，180 r/min、50 ℃振荡培养。5 d时取培养液4 ℃、8 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。羧甲基纤维素酶酶活测定[8]：取1 mL稀释后的粗酶液至试管中，加1 mL 1%的CMC-Na溶液和1 mL柠檬酸钠溶液（0.1 mol/L，pH值4.5）混匀，于50 ℃水浴反应30 min，取出，加入DNS显色液1.5 mL，沸水浴5 min，冷却至室温，100 ℃煮沸10 min失活的粗酶液作为空白对照组，其他步骤相同，每组3个平行。采用3,5-二硝基水杨酸比色法在540 nm下测定还原糖的量，计算酶活。酶活力单位（U/mL）：每分钟转化底物产生1 nmol还原糖所需的酶量。1.2.3分子生物学鉴定菌株DNA提取：按照细菌基因组提取试剂盒或真菌基因组提取试剂盒的操作步骤分别提取菌株的基因组DNA，提取的DNA使用Tnano-700检测浓度（mg/L）及纯度（A260/A280），使用1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。PCR扩增及测序：以提取的细菌基因组DNA为模板，选用细菌通用引物（上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增。扩增体系（25 μL）：ddH2O 10 μL、PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板0.5 μL。反应程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增。扩增体系（25 μL）：DNA模板2 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL、PCR Master Mix 12.5 μL。反应程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪观察结果，将阳性PCR产物送至武汉擎科生物技术有限公司进行16S rDNA或ITS测序分析。1.3数据统计与分析采用Microsoft Excel 2019对试验数据进行初步处理和图表绘制，SPSS 13.0软件对数据进行显著性分析。测序结果在NCBI上采用BLAST程序与GenBank中微生物基因序列进行同源分析，在NCBI中下载比对相似度高的序列及种属参考序列，采用MEGA7.0进行序列比对分析后，Phylogeny菜单中的Test Neighbor-joining Tree方法构建系统发育树。2结果与分析2.1纤维素降解菌的分离与筛选（见图2、表1）以奶牛粪污异位发酵床高温期堆肥物料为菌源，在50 ℃条件下，经过多次富集培养和分离纯化，初步筛选得到10株菌（a1、a2、a4、a5、a6、a7、a8、b1、b3、b4）；将筛选的菌株接种至刚果红培养基，50 ℃恒温培养2 d，10株菌在刚果红培养基上的生长情况见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.014.F002图210株菌在刚果红培养基上的生长情况由图2可知，各菌株均产生大小不同的水解圈。由表1可知，10株菌的D/d为1.10~4.50，其中a2、a4、b1、b3的D/d分别为2.09、1.75、4.50、3.51，高于其他菌株；初步判断筛选的10株菌对纤维素均具有一定降解能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.014.T001表1纤维素降解菌水解圈与菌落直径菌株编号D/mmd/mmD/da115.55±0.3410.42±0.231.49±0.03a215.71±0.237.52±0.332.09±0.08a420.64±0.3511.77±0.111.75±0.04a520.56±0.3918.69 ±0.281.10±0.01a615.57±0.3610.70 ±0.171.45±0.05a730.75±0.2620.64 ±0.281.49±0.01a835.55±0.2025.67±0.201.39±0.01b125.55±0.205.69±0.274.50±0.19b320.56±0.215.87±0.193.51±0.14b420.66±0.2318.72±0.281.10±0.012.2滤纸条崩解试验结果（见图3）由图3可知，接种a2、a4和a8菌液的培养瓶中，培养液浑浊，滤纸条降解为糊状；菌株a1、a5、a6培养瓶中，滤纸条未见明显断裂，仅降解了滤纸条边缘部分；菌株a7、b1、b3、b4和空白对照CK的滤纸条未见变化。研究表明，菌株a2、a4和a8对滤纸条具有明显的崩解效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.014.F003图3菌株在10 d时对滤纸条的降解效果2.310株菌株羧甲基纤维素酶酶活测定结果（见表2）由表2可知，10株菌的羧甲基纤维素酶酶活为18.11~168.92 U/mL；其中a4羧甲基纤维素酶的酶活最高，为168.92 U/mL；其次是a2和a8菌株，酶活分别为104.32和114.98 100 U/mL；a7和b3酶活相对较低，分别为18.11和20.18 U/mL。研究表明，菌株a2、a4、a8具有高的产酶能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.014.T002表210株菌株羧甲基纤维素酶酶活测定结果菌株结果菌株结果a1339.92±0.86a718.11±1.20a2104.32±0.69a8114.98±0.98a4168.92±1.03b136.00±0.89a556.71±0.98b320.18±1.15a647.70±0.75b431.94±0.76U/mL结合刚果红培养基水解圈D/d值大小、滤纸条崩解能力和羧甲基纤维素酶酶活测定试验结果，筛选得到耐高温、纤维素降解能力佳及高产酶的3株菌a2、a4和a8。2.4菌株分子生物学鉴定结果（见图4、图5）由图4、图5可知，根据基因序列比对结果及系统发育树分析，鉴定a2为嗜热链霉菌（Streptomyces thermovulgaris），a4和a8为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.014.F004图4菌株a2系统发育树10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.014.F005图5菌株a4、a8系统发育树3讨论好氧堆肥过程中添加纤维素降解菌，尤其是耐高温纤维素降解菌，可有效促进纤维素降解，加快堆肥物料的腐熟，从而缩短堆肥周期，提高堆肥产物质量，且来自堆肥物料中的高效纤维素降解菌，具有利于提高菌株的定植力、稳定性和降解纤维素的效果[9-10]。本研究以奶牛粪污异位发酵床高温期物料为菌源，从中筛选得到3株具有耐高温、高产酶特性的菌株a2、a4和a8，其中a2为链霉菌属，a4和a8为芽孢杆菌属。链酶菌属微生物是土壤中的优势放线菌群，在周围环境中分泌一系列参与植物木质纤维素的生物降解酶，具有良好的pH值耐受性和温度稳定性，在碱性和高温环境下仍然具有较高的酶活性，能够降解作物秸秆、锯末等可溶性的木质碳水化合物[11-12]。赖国栋等[13]筛选得到的Y6丝状链霉菌（Streptomyces filamentosuss），50 ℃培养5 d、羧甲基纤维素酶酶活为30.694 U/mL。纪莹莹[14]分离得到高效降解纤维素菌株A7为链酶菌（Streptomyces sp.），50 ℃恒温培养5 d，羧甲基纤维素酶酶活为44.27 U/mL。本研究筛选的a2菌株，在50 ℃、pH值6.0条件下培养5 d，羧甲基纤维素酶酶活可达104.32 U/mL，明显高于上述报道结果，表明该菌株在高温条件下具有高产酶能力，有利于纤维素降解。芽孢杆菌属是自然界分布极广的一类细菌，因具有芽孢、耐碱、耐酸、耐高温、适应能力强等特点，广泛应用于堆肥，其中地衣芽孢杆菌还具有嗜热、兼性厌氧和降解有害物质等特性[15]。程旭艳等[16]从滤泥堆肥中筛选的菌株HN-5为嗜热芽孢杆菌（Bacillus kaustophilus），在50 ℃、pH值6.0条件下培养5 d，羧甲基纤维素酶酶活为76.136 U/mL，在鸡粪好氧堆肥中添加此菌株可有效促进堆体升温、延长高温期持续时间。黄颖婕等[17]从牛粪秸秆堆肥中分离获得的解淀粉芽孢杆菌X7（Bacillus amyloiquefaciens），10 d内完全崩解滤纸条，37 ℃培养3 d，纤维素酶活为40.02 U/mL。本研究筛选的菌株a4和a8在50 ℃恒温培养条件下，10 d能够完全崩解滤纸条；50 ℃、pH值6.0条件下培养5 d，羧甲基纤维素酶酶活分别为168.92、114.98 U/mL。因此，菌株a4和a8的酶活性远远高于上述分离的菌株，表明本研究分离的两株地衣芽孢杆菌具有可开发耐高温纤维素降解菌剂的潜力。本研究筛选得到的3株高温降解菌，50 ℃恒温培养经过多次纯化后生长较好，具有较强的产酶和降解纤维素能力，但有关嗜热链霉菌a2菌株高产酶活性的报道较少，具有较高的研究价值。关于菌株的生化特性、产酶条件及其在粪污降解过程中耐高温、降解纤维素与生产运用的效果有待进一步研究。4结论本研究从奶牛粪污异位发酵床高温期物料中筛选得到的a2、a4和a8菌株，50 ℃恒温条件下，10 d完全崩解滤纸条；50 ℃、pH值6.0条件下培养5 d，羧甲基纤维素酶活分别为104.32、168.92、114.98 U/mL。分子生物学鉴定发现，菌株a2为嗜热链霉菌，a4和a8为地衣芽孢杆菌。