我国蔬菜产业迅速发展，产生了大量分布广泛的蔬菜废弃物——尾菜。但蔬菜废弃物随意堆放，腐烂分解后会造成资源浪费及污染环境，亟须开发利用蔬菜废弃物资源。目前，对尾菜的处理主要包括填埋、焚烧、堆肥、饲料化和厌氧消化，但仍存在一些需要解决的问题。青贮是利用菌种发酵，使原料中的可溶性糖类物质产生乳酸和其他有机酸，形成酸性环境条件，抑制腐败菌繁殖，进而维持原料营养价值的方法[1]。将尾菜用作原料进行青贮化应用，能够解决尾菜腐烂引发的环境污染问题，丰富饲料资源。乳酸菌能够促进青贮原料发酵酸化成熟产生大量乳酸[2]，关于乳酸菌在青贮饲料制备中应用的研究较多[3-4]，且多集中于优良青贮菌种的筛选[5]、乳酸菌生长状况对青贮饲料品质的影响[6]、青贮发酵剂的研发[7]、青贮饲料添加乳酸菌对奶牛生理功能的影响[8]。筛选适合榆中县蔬菜废弃物青贮的优良乳酸菌，对当地制作蔬菜废弃物青贮饲料具有重要意义。本试验对蔬菜废弃物附着的乳酸菌进行分离、生理生化和分子鉴定，从中确定适合蔬菜废弃物青贮的乳酸菌菌株，为制备蔬菜废弃物青贮功能发酵菌剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1青贮饲料样品尾菜、麸皮、米糠、玉米纤维均由甘肃帝旺生物科技有限责任公司提供。1.1.2培养基MRS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.17 g、H2O 1 000 mL，调pH值6.5，固体培养基加入琼脂15.0 g/1 000 mL。1.1.3仪器设备LDZM-80KCS-Ⅱ型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、SW-CJ-2FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、LC-2030高效液相色谱仪、（UV-120-02紫外可见分光光度计（岛津公司）、MJ-150Ⅱ培养箱（上海一恒科技有限公司）、ZRN-pH-D型台式pH计（北京中瑞能仪表技术有限公司）。1.2测定指标及方法1.2.1尾菜青贮饲料制备将原料按尾菜70%、麸皮10%、米糠10%、玉米纤维10%比例充分混匀，按200 g/袋装入无菌塑料袋中，抽真空并封口，置于室温条件下贮存，在青贮第55 d开启取样，对青贮尾菜饲料中的乳酸菌进行筛选分离。1.2.2乳酸菌的分离与保藏在无菌操作台中称取青贮尾菜饲料10 g，放入90 mL已灭菌蒸馏水的锥形瓶摇匀，稀释至10-1~10-7浓度梯度，依次从10-3、10-4、10-5浓度梯度移取0.1 mＬ涂板至MRS琼脂平皿中央，（37±1）℃培养24~72 h。根据菌体形态观察将筛选所获菌株进行革兰染色，油镜下观察菌体细胞形态，测定过氧化氢触酶活性。革兰氏阳性菌并且触酶阴性均判定是疑似乳酸菌[9-12]，继续分化培养。在MRS固体培养基平板上进一步分离和纯化疑似乳酸菌后，将纯培养物转移到斜面固体培养基中生长，培养长成后存放在摄氏4 ℃的冰箱内。1.2.3乳酸菌形态特征检测将纯化的菌种于MRS平板涂布培养1~2 d，形成菌落后描述其形态，挑取典型菌落，进行涂片革兰氏染色。1.2.4乳酸菌分离株的生理生化特征鉴定采用文献[13]至文献[15]步骤测定菌株过氧化氢酶特性和葡糖酸盐产酸产气情况。乳酸菌分离株在5、10、40和45 ℃恒温条件下分别培养14、14、7和7 d，观察相应乳酸菌菌株的生长情况。37 ℃恒温条件下，乳酸菌分离株在pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5、8.0条件下分别培养48 h，观察对应组乳酸菌菌株的生长情况，记录乳酸菌菌株的耐酸特质。37 ℃恒温条件下，乳酸菌分离株分别在NaCl浓度为3.0%和6.5%条件下培养48 h，观察乳酸菌菌株的生长情况。37 ℃恒温条件下，乳酸菌分离株培养48 h，通过API50试剂盒（法国 BioMerieux 公司）判断分析乳酸菌分离株对49种碳源的发酵利用情形。1.2.5乳酸菌分离株的16S rRNA基因序列分析在MRS液体培养基中分别转入乳酸菌分离株，培养12 h，使用细菌试剂盒提取相应乳酸菌基因组。利用通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492r（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3'）[16-17]对供试乳酸菌进行PCR扩增，合格PCR产物送至上海美吉生物技术有限公司测序，对测序结果进行BLAST比对。1.2.6优良乳酸菌菌株产酸速率测定在MRS液体培养基中分别接种3%的3株供试乳酸菌菌悬液，37 ℃静置恒温培养，在24 h内每隔2 h取样1次，测定并分析每个对应时间点乳酸菌菌液的酸碱度值，得到酸度变化速率曲线[18-19]。1.2.7优良乳酸菌菌株的生长曲线测定在MRS液体培养基中分别接种3%的3株供试乳酸菌菌悬液，37 ℃静置恒温培养，36 h内每隔2 h取样1次。MRS培养基为空白对照，采用紫外可见分光光度计在波长600 nm处测定、分析各对应时间点乳酸菌菌株发酵液的OD600 nm值，得到各菌株的生长曲线[20]。2结果与分析2.1尾菜青贮型乳酸菌的分离结果通过MRS培养基，从尾菜青贮饲料中共分离得到3株革兰氏染色阳性、过氧化氢阴性的乳酸菌菌株，分别标记为R-1、R-2、R-3。2.2尾菜青贮型乳酸菌菌株的鉴定结果2.2.1乳酸菌的形态学特性（见表1）由表1可知，3株乳酸菌在MRS固体培养基上呈表面光滑且边缘整齐的乳白色菌落，其中有1株为球菌、2株为杆菌，革兰氏染色全部显现阳性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.018.T001表1乳酸菌形态学特征菌株菌落形态菌体形态革兰染色结果R-1颜色为乳白色且不透明，边缘整齐且中心有凸起单在的球菌G+阳性R-2颜色为乳白色且不透明，表面光滑、边缘整齐有凸起成对的杆菌G+阳性R-3颜色为乳白色且不透明，表面光滑且边缘整齐成对的杆菌G+阳性2.2.2乳酸菌的过氧化氢酶试验结果（见表2）由表2可知，尾菜青贮饲料样品中分离到的3株菌R-1、R-2、R-3滴加3%~10%的H２O２溶液后不产生气泡，均表现为过氧化氢酶阴性，初步确定为乳酸菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.018.T002表2乳酸菌的过氧化氢酶试验结果项目R-1R-2R-3结果---注：“+”表示反应为阳性；“-”表示反应为阴性；下表同。2.2.3乳酸菌葡萄糖发酵产酸产气试验结果（见表3）由表3可知，3株乳酸菌R-1、R-2、R-3均是能够利用葡萄糖产酸但不产气的同型发酵乳酸菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.018.T003表3乳酸菌葡萄糖发酵产酸产气试验结果菌株产气乳酸菌发酵类型R-1-同型发酵R-2-同型发酵R-3-同型发酵2.2.4乳酸菌菌株温度耐受试验结果（见表4）由表4可知，在5.0 ℃下，R-3生长良好，而其他2株乳酸菌生长较弱，表明R-3比其他2株菌更耐低温。在10.0、40.0 ℃下，3个乳酸菌分离株全部生长良好。在45.0 ℃下，乳酸菌分离株R-1的生长受到抑制，R-2和R-3生长良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.018.T004表4乳酸菌菌株温度耐受试验结果菌株5.0 ℃10.0 ℃40.0 ℃45.0 ℃R-1w++-R-2w+++R-3++++注：“w”表示反应为弱阳性；下表同。2.2.5乳酸菌菌株pH值耐受试验结果（见表5）由表5可知，在pH值3.0环境下，R-1和R-2生长受到抑制，只有R-3微弱生长；pH值3.5时，R-3生长良好，其他2株菌生长较弱，表明R-3比其他2株菌更能够耐受酸性；pH值4.0~8.0时，3株乳酸菌均长势很好。研究表明，乳酸菌分离株均具有一定耐酸碱特性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.018.T005表5乳酸菌菌株pH值耐受试验结果菌株pH值3.03.54.04.55.07.58.0R-1-w+++++R-2-w+++++R-3w++++++2.2.6乳酸菌菌株耐盐性试验结果（见表6）由表6可知，3株菌在3.0%、6.5%的NaCl条件下均可正常生长，均具有很强的耐盐能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.018.T006表6乳酸菌菌株耐盐性试验结果菌株NaCl浓度3.0%6.5%R-1++R-2++R-3++2.2.7乳酸菌API50CH碳源发酵试验结果（见表7）由表7可知，乳酸菌分离株R-1、R-2及R-3均能够通过利用柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、核糖、蜜二糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖、果糖及甘露糖、N-乙酰-葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶灵发酵。乳酸菌分离株R-1、R-2及R-3利用肌醇、赤藓糖醇、D-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖苷、棉籽糖、淀粉、肝糖、木糖醇、甘油、山梨糖、D-来苏糖及卫矛醇、D-岩糖、L-岩糖、α-甲基-D-甘露糖苷、D-阿拉伯糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐均呈阴性。乳酸菌分离株R-1、R-2和R-3对L-阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖、菊糖、松三糖、龙胆二糖、D-松二糖、D-塔格糖、葡萄糖酸盐、5-酮基-葡萄糖酸盐的利用方式存在一定区别。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.018.T007表7乳酸菌API50CH碳源发酵试验结果项目R-1R-2R-3项目R-1R-2R-3柳醇+++葡萄糖+++肌醇---淀粉---赤藓糖醇---果糖+++纤维二糖+++肝糖---D-阿拉伯糖---甘露糖+++麦芽糖+++木糖醇---L-阿拉伯糖+-+甘油---乳糖+++龙胆二糖+--核糖+++鼠李糖w--蜜二糖+++D-松二糖-++D-木糖---山梨糖---蔗糖+++D-来苏糖---L-木糖---卫矛醇---海藻糖+--D-塔格糖+--阿东醇---甘露醇-++菊糖--+D-岩糖---β－甲基-D-木糖---山梨醇-++松三糖-+-L-岩糖---半乳糖+++α-甲基－D-甘露糖苷---棉籽糖---D-阿拉伯糖醇---α-甲基-D-葡萄糖苷---2-酮基-葡萄糖酸盐---L-阿拉伯糖醇---熊果苷+++N-乙酰-葡萄糖胺+++5-酮基-葡萄糖酸盐-ww葡萄糖酸盐w-+七叶灵+++苦杏仁苷+++2.2.8乳酸菌菌株的16S rＲNA基因序列分析结果（见表8）由表8可知，乳酸菌R-1、R-2和R-3基因序列与标准菌株基因序列的同源性均达99%以上，鉴定菌株R-1为乳酸乳球菌，菌株R-2、R-3为嗜酸乳杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.018.T008表8乳酸菌菌株的16S rＲNA基因序列分析结果菌株近源种相似度/%R-1乳酸乳球菌≥99R-2、R-3嗜酸乳杆菌1002.3性状优良乳酸菌的筛选结果2.3.1乳酸菌产酸速率曲线（见图1）由图1可知，不同菌株在发酵过程中pH值的变化趋势有所不同，R-2、R-3菌株的pH值的下降速率比R-1快，表明杆菌的产酸能力比球菌强。菌株R-3的产酸速率和产酸能力整体趋势呈最强，pH值可达3.60，具备良好的青贮潜力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.018.F001图1乳酸菌菌株产酸速率曲线2.3.2乳酸菌分离株的生长曲线（见图2）由图２可知，菌株R-1、R-2和R-3的生长情况均较好，约在培养2 h后进入对数生长期，2~8 h生长速度较快；随后进入稳定生长期，菌液OD600 nm值变化较小，36 h后菌株R-1、R-2和R-3发酵液的OD600 nm值分别为2.16、2.31、2.47，表明R-3的生长能力最旺盛。综合产酸速率和生长曲线可知，菌株R-3产酸能力和生长性能均较好，适宜用作尾菜青贮发酵的菌株。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.018.F002图2乳酸菌分离株的生长曲线3讨论在尾菜青贮发酵过程中，乳酸菌是青贮发酵的主要益生菌资源，常被用作青贮饲料的生物添加剂[21]，可优化青贮饲料的发酵品质[22]，能够提升青贮饲料发酵后期的有氧稳定性[23]，达到长期贮藏尾菜青贮饲料养分的效果。在青贮发酵过程中，菌株的产酸能力和繁殖速率是筛选青贮优良乳酸菌菌株的重要评价指标[24]。性状优良的乳酸菌菌株发酵后可迅速降低青贮饲料pH值，提高有机酸含量，抑制有害微生物繁殖[25]，缩减青贮饲料有效发酵周期，提高蔬菜废弃物青贮饲料产品的质量品质。本试验从尾菜青贮饲料中分离出3株乳酸菌，经过形态特征、生理生化鉴定和16S rRNA序列分析鉴定，初步确定R-1为乳酸乳球菌，R-2、R-3为嗜酸乳杆菌，且均为同质型发酵乳酸菌。通过对3株乳酸菌产酸速率及生长特性的检测，筛选出生长速度快、产酸性能好的R-3菌株，经比较分析，表明嗜酸乳杆菌R-3为最适宜用作尾菜青贮的菌株。4结论本试验分离的R-3嗜酸乳杆菌来源于尾菜青贮饲料，具备优质青贮乳酸菌菌株的特征，可作为制作青贮饲料的优良菌株。