羔羊断奶阶段经历了由液态的母乳到固态的日粮转变过程，此时消化系统、免疫器官尚未完全发育，会产生一系列的应激综合征。植物提取物具有改善动物健康、提高动物生产性能的重要作用。本课题组前期研究表明，沙蒿多糖能够抑制消化道中有害菌的生长繁殖，调节反刍动物瘤胃中微生物发酵，从而提高机体对营养物质的吸收，促进动物的生长发育[1-2]。丁酸甘油酯和包膜丁酸钠在肠道内均可水解产生丁酸，能够快速、直接地为胃肠道上皮细胞的生长发育提供能量，改善胃肠道健康[3]。目前，沙蒿多糖与丁酸类物质在反刍动物中的研究相对较少，且主要集中于猪、鸡等单胃动物以及沙蒿多糖或丁酸等单一物质，关于二者结合对滩羊断奶羔羊肠道作用的机理鲜有报道。本试验通过16S rDNA高通量测序技术研究沙蒿多糖组合制剂对滩羊羔羊肠道内细菌组成与细菌群落多样性的影响，为缓解断奶应激对动物机体的负面影响，保证滩羊羔羊的健康发育提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用的沙蒿多糖、丁酸甘油酯和包被丁酸钠与课题组张俊丽等[4]所用材料相同。1.2试验设计试验在宁夏灵诚农牧科技有限公司养殖场进行。选择健康、体重相近的60只断奶滩羊公羔，随机分为4组，每组15个重复，每个重复1只羊。对照组断奶滩羊饲喂基础日粮，试验1组、2组、3组分别在基础日粮中添加5.5 g/d沙蒿多糖+5.5 g/d包被丁酸钠、5.5 g/d沙蒿多糖+5.5 g/d丁酸甘油酯、5.5 g/d沙蒿多糖+1.1 g/d莫能菌素。沙蒿多糖、丁酸甘油酯与包被丁酸钠的水平参考课题组前期研究结果设定[1-2]，高于饲养标准基础[5]；莫能菌素水平参考产品说明的最佳添加剂量设定。参照NRC（2007）饲养标准配制基础日粮，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米秸秆8.75代谢能/(MJ/kg)9.02稻草8.75干物质/%80.45苜蓿3.50粗蛋白/%13.49玉米青贮14.00钙/%0.62玉米28.60磷/%0.55次粉5.20麸皮2.60米糠1.95亚麻仁饼3.25菜籽粕3.25棉籽粕3.25玉米蛋白粉3.25玉米胚芽粕1.95DDGS1.30向日葵仁饼1.95苹果渣3.25苦豆渣1.95预混料3.25注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 3 000 IU、VD 1 000 IU、VE 20 mg、钴0.2 mg、铜10 mg、碘1.0 mg、铁25 mg、锰20 mg、硒0.25 mg、锌35 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理试验期间所有羊于8：00和17：00由专人饲喂，自由饮水。每组羊的饲养管理及环境条件均保持一致，预试期15 d，正式试验期60 d。1.4测定指标及方法1.4.1样品采集试验最后1 d，每组随机选取3只羊屠宰，采集十二指肠、空肠和回肠内容物置于5 mL冻存管，-80 ℃保存。1.4.2基因组DNA提取和PCR扩增样品基因组DNA提取按照粪便基因组提取试剂盒的步骤进行。采用琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子质量，紫外分光光度计（Nanodrop）检测DNA浓度和纯度。以V3和V4为目标区域进行引物设计，引物序列为：319F：GTACTCCTACGGGAGGCAGCA；806R：GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR反应体系（25 μL）为：模板DNA 30 ng、上下游引物（5 μmol/L）各1 μL、BSA（2 mg/L）3 μL、2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，采用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物直接进行纯化，按测序要求进行混合。1.4.3Miseq测序测序在Mixed PE 300平台上进行，由北京奥维森基因科技有限公司完成。1.5数据统计与分析试验数据采用SAS 9.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1沙蒿多糖组合制剂对滩羊羔羊肠道OTU数量的影响（见图1~图3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.F001图1十二指肠菌群Venn图注：SEZC、KC、HC为十二指肠、空肠、回肠；1、2、3、4为沙蒿多糖+包被丁酸钠组、沙蒿多糖+丁酸甘油酯组、沙蒿多糖+莫能菌素组和对照组；图2~图7与此同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.F002图2空肠菌群Venn图由图1~图3可知，4个组羔羊十二指肠产生的OTU总数为2 250个，试验2组、对照组、试验1组与试验3组独有的OTU数目分别为537、303、244、79个；4个组羔羊空肠产生的OTU总数为1 145个，试验1组、试验2组、试验3组与对照组独有的OTU数目分别为192、125、67与41个；4个组羔羊回肠产生的OTU总数为1 908个，试验2组、对照组、试验1组与试验3组各组独有的OTU数目分别是330、142、66、42个，表明试验2组十二指肠和回肠内特有微生物的种类以及其多样性有所提高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.F003图3回肠菌群Venn图2.2Alpha多样性分析2.2.1样品的稀释曲线和Shannon曲线（见图4、图5）由图4可知，随着测序深度的增加，曲线逐渐趋于平坦，表明此时测序数据量合理。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.F004图4样品的稀释曲线由图5可知，样品Shannon曲线趋势与图4类似，当测序深度较小时，Shannon曲线迅速增加；当测序深度达到5 000 reads时，Shannon曲线变缓，逐渐接近于饱和状态。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.F005图5样品的Shannon曲线结果表明，当测序深度达到5 000 reads时，该数据量已足够进行样品菌群多样性分析。2.2.2Alpha多样性分析（见表2）由表2可知，试验2组羔羊空肠与回肠样品中Chao1指数高于其他组，表明试验2组羔羊空肠与回肠中细菌群落总数均高于其他部位。试验2组羔羊十二指肠、空肠与回肠样品中Shannon指数与Simpson指数最高，表明试验2组样品中细菌的多样性最丰富。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.T002表2Alpha多样性分析肠段项目对照组试验1组试验2组试验3组标准误P值十二指肠Chao1指数718.225730.970633.225704.210146.3000.978Shannon指数4.8954.8556.2535.0570.6000.414Simpson指数0.9300.7810.9430.9210.0430.131覆盖率/%99.33399.667100.00099.3330.2890.363空肠Chao1指数518.540500.887600.313431.53349.9960.204Shannon指数5.257ab4.733b5.793a4.597b0.2630.044Simpson指数0.9410.8970.9610.9110.0110.103覆盖率/%100.000100.000100.000100.000——回肠Chao1指数533.685763.747978.673575.457191.0870.437Shannon指数4.8305.8337.1205.5530.6770.248Simpson指数0.9330.9430.9730.9470.0190.506覆盖率/%99.66799.33399.33399.6670.3330.802各试验组的测序覆盖率均高于99%，表明测序数据量合理，且能够很好地反映滩羊肠道菌群微生物群落情况。2.3滩羊肠道细菌组成和群落结构分析2.3.1滩羊肠道门水平结构分析（见表3、图6）由表3、图6可知，4个组滩羊十二指肠中所含的菌门主要为放线菌门、厚壁菌门和变形菌门，占总细菌90%以上。试验2组滩羊十二指肠中厚壁菌门的相对丰度显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.T003表3沙蒿多糖组合制剂对滩羊肠道菌群在门水平的丰度影响肠段项目对照组试验1组试验2组试验3组标准误P 值十二指肠放线菌门（Actinobacteria）40.55451.41127.57539.68914.6320.729厚壁菌门（Firmicutes）29.792b36.749ab63.511a51.147ab8.0150.041变形菌门（Proteobacteria）9.5990.4942.3115.4154.8450.422蓝藻菌门（Cyanobacteria）11.1723.3050.4370.9542.8090.597软壁菌门（Tenericutes）2.9015.3950.1981.1060.8590.726糖细菌门（Saccharibacteria）2.8370.4713.9430.2693.4820.336拟杆菌门（Bacteroidetes）1.3530.6091.6930.5122.3150.629Gemmatimonadetes0.9210.0180.1070.0100.2160.484Acidobacteria0.3680.0300.0440.7590.2080.488空肠放线菌门（Actinobacteria）32.652b35.493b26.675b57.820a5.4200.017厚壁菌门（Firmicutes）65.095a60.563a69.597a40.245b5.1520.017糖细菌门（Saccharibacteria）0.9510.2902.7360.8680.9320.343变形菌门（Proteobacteria）0.3630.8520.0370.4110.4080.592蓝藻菌门（Cyanobacteria）0.2200.1230.2610.3000.1210.761拟杆菌门（Bacteroidetes）0.2340.8360.0080.1380.4330.569软壁菌门（Tenericutes）0.2780.9690.4550.0830.3980.477广古菌门（Euryarchaeota）0.0570.0350.0520.0700.0350.911未分类序列（unidentified）0.0120.0130.0110.0330.0090.303疣微菌门（Verrucomicrobia）0.1300.0360.1680.0110.0920.599回肠厚壁菌门 （Firmicutes）65.75968.65573.15863.9086.8300.792放线菌门 （Actinobacteria）29.06822.97913.38131.9537.7290.394拟杆菌门（Bacteroidetes）1.7144.6426.9672.2943.4390.700软壁菌门（Tenericutes）0.3771.7151.6090.5490.4190.111变形菌门（Proteobacteria）0.3240.9490.5580.4420.2350.331蓝藻菌门（Cyanobacteria）0.1610.0730.3080.3810.1730.606糖细菌门（Saccharibacteria）2.2300.2682.1920.2901.2690.541螺旋菌门（Spirochaetae）0.2060.5810.4160.0830.3580.769广古菌门（Euryarchaeota）0.0620.0240.0770.0540.0360.763疣微菌门（Verrucomicrobia）0.071b0.041b0.314a0.024b0.0420.045注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4与此同。%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.F006图6滩羊肠道门水平上肠道菌群分析空肠中所含的菌门主要为放线菌门和厚壁菌门，占总细菌95%以上。试验3组滩羊空肠中放线菌门的相对丰度显著高于对照组（P0.05）。回肠中所含的菌门主要为厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门，占总细菌90%以上。试验2组滩羊回肠中疣微菌门的相对丰度显著高于对照组（P0.05）。2.3.2滩羊肠道属水平结构分析（见表4、图7）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.T005部位项目对照组试验1组试验2组试验3组标准误P 值回肠Romboutsia6.70610.5633.2317.7575.1270.791Peptoclostridium2.7084.6415.7857.2483.6050.837啮齿真杆菌（Eubacterium_coprostanoligenes_group）6.9106.6456.5396.2673.0000.999瘤胃球菌属_gauvreauii（Ruminococcus_gauvreauii_group）6.8082.7952.2254.2453.1420.741互营球菌属（Syntrophococcus）2.5807.0640.9194.1683.1940.594Pseudoscardovia0.3662.1340.0163.9721.8000.432瘤胃球菌属_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）8.6074.6578.0753.9245.5910.907Family_􀃼_AD3011_group2.1620.8892.8552.7731.0250.535粪球菌属_1（Coprococcus_1）2.1200.7580.8782.6091.0650.557克里斯滕森菌属_R-7（Christensenellaceae_R-7_group）3.6811.1306.5082.2152.3650.452毛螺旋菌科（Acetitomaculum）0.7021.5441.8381.6150.5310.492缠结优杆菌（Eubacterium_nodatum_group）0.6352.1490.6791.4090.5970.303Terrisporobacter0.0031.8160.0251.2970.8260.361瘤胃球菌属_UCG-010（Ruminococcaceae_UCG-010）0.5720.9831.7621.1400.9250.835瘤胃球菌属_UCG-014（Ruminococcaceae_UCG-014）1.5131.6871.8511.1300.6210.860Turicibacter0.6621.5331.0160.9790.6310.806Clostridium_sensu_stricto_10.5661.4500.3350.8520.4910.456Aeriscardovia6.4321.4480.1170.5493.1370.498由表4、图7可知，试验1组十二指肠内容物中Sharpea和Solanum_torvum的相对丰度显著低于对照组（P0.05），试验2组十二指肠Solanum_torvum的相对丰度显著低于对照组（P0.05）。空肠内容物中试验2组的乙酸菌属相对丰度显著高于对照组（P0.05）。回肠内容物中试验1组和3组奥尔森菌属、Romboutsia、Peptoclostridium和互营球菌属的相对丰度均高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.T004表4蒿多糖组合制剂对滩羊肠道菌群在属水平的丰度影响肠段项目对照组试验1组试验2组试验3组标准误P 值十二指肠奥尔森菌属（Olsenella）20.72617.72719.30611.30612.7990.955unidentified13.91714.34113.7616.8924.1040.550Candidatus_Saccharimonas7.9510.4852.2685.2253.0180.374双歧杆菌属（Bifidobacterium）7.8962.0130.3761.8123.0880.383气斯卡多维亚氏菌属（Aeriscardovia）5.32626.1330.1378.67910.2130.364瘤胃球菌属_gauvreauii（Ruminococcus_gauvreauii_group）3.4175.0205.4077.6642.1550.599Sharpea3.237a0.309b0.649ab1.230ab0.8080.022Tabrizicola2.8090.0610.0000.0611.2690.373粪球菌属（Coprococcus_1）2.3041.0251.7561.0621.2120.856Family_Ⅻ_AD3011_group2.2891.2034.9081.9231.0450.150啮齿真杆菌（Eubacterium_coprostanoligenes_group）2.2681.7433.9015.8991.9510.473互营球菌属（Syntrophococcus）2.0527.7272.2775.9283.9050.686Catenisphaera1.7823.4311.8800.9781.3760.659毛螺菌属_NK3A20（Lachnospiraceae_NK3A20_group）1.6440.0666.2930.4562.2970.274Candidatus_Saccharibacteria_bacterium_UB25231.4340.0080.0430.1650.4810.190瘤胃球菌属_UCG-014（Ruminococcaceae_UCG-014）1.2471.7401.8328.1433.6400.523Senegalimassilia1.2180.4022.2540.2310.9100.428Mogibacterium1.1940.3460.4461.9830.5340.188Solanum_torvum1.153a0.020b0.008b0.334ab0.3270.015定会杆菌（Dinghuibacter）1.0790.0200.0000.0240.4940.383空肠奥尔森菌属（Olsenella）19.78021.05416.10734.6166.6810.295毛螺菌科_NK3A20（Lachnospiraceae_NK3A20_group）8.8960.28913.2490.8954.5040.198unidentified8.1718.05811.9789.4581.0320.105啮齿真杆菌（Eubacterium_coprostanoligenes_group）6.9443.1603.5156.5151.6190.291瘤胃球菌属_gauvreauii（Ruminococcus_gauvreauii_group）6.4084.9287.4037.7273.1880.923Romboutsia6.1885.4741.8640.0023.1050.483Family_􀃼_AD3011_group4.4731.2133.2373.1251.0020.224Peptoclostridium3.6291.5392.0110.0031.4290.407Sharpea3.1441.7431.6060.1561.1320.381互营球菌属（Syntrophococcus）3.0249.8042.8332.5213.9290.528双歧杆菌属（Bifidobacterium）2.9560.7480.7950.2650.9980.300Senegalimassilia2.9280.7633.2390.6381.0860.260粪球菌属_1（Coprococcus_1）2.8051.3863.6774.5141.7730.652Aeriscardovia2.5392.0810.3767.9542.6470.279Catenisphaera2.16613.4783.3951.6314.7570.317乙酸菌属（Acetitomaculum）2.015b3.137ab6.319a1.586b1.0850.046艰难杆菌属（Mogibacterium）1.4260.4350.8760.5580.4180.397回肠奥尔森菌属（Olsenella）13.11715.3278.31923.9895.4920.305unidentified6.18010.77412.5008.6222.7740.452续表4　蒿多糖组合制剂对滩羊肠道菌群在属水平的丰度影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.002.F007图7滩羊肠道属水平分布3讨论3.1沙蒿多糖组合制剂对滩羊肠道微生物区系在门水平上的影响动物肠道寄居着细菌、古菌、真菌和原虫等大量微生物。动物个体、年龄、健康情况和生活环境等均会对动物的肠道微生物区系的形成产生影响[6]。微生物组成多样性对宿主的肠道结构功能、营养供给、免疫力等方面均具有重大影响[7]。研究表明，反刍动物胃肠道中的优势菌门主要是拟杆菌门和厚壁菌门[8-9]。本试验中，羔羊十二指肠、空肠和回肠中的优势菌群均为厚壁菌门和放线菌门，与上述结论存在差异。原因可能是选取动物的品种、日龄、饲粮构成、采样部位与方式以及测试区域的存在差别。厚壁菌门和拟杆菌门在能量的产生和代谢中起重要作用[10-11]。本试验发现，试验2组羔羊十二指肠中厚壁菌门及试验3组羔羊空肠中放线菌门的相对丰富度明显优于对照组。Tumbaugh等[12]研究发现，小鼠的肥胖程度与肠道富集的细菌种类相关，与肠道富集拟杆菌门细菌的小鼠相比，富集厚壁菌门细菌的小鼠较肥胖。原因可能是厚壁菌门细菌富含有助于促进机体吸收能量的淀粉酶、半乳糖酶及丁酸酶等，更易促进脂肪沉积[13]。变形菌门包括大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌等多种病原菌[14]。本试验中，与对照组相比，各试验组中羔羊肠道变形菌门的相对丰度无显著差异，但均有所降低，表明添加沙蒿多糖组合制剂在一定程度上可促进肠道菌群平衡。目前，关于沙蒿多糖与丁酸类物质联合使用对肠道菌群影响的研究相对较少，且多以沙蒿多糖或丁酸类等单一物质为研究内容。本课题组前期研究发现，日粮中添加沙蒿多糖可使弧菌、空肠弯曲菌等肠道致病菌的相对丰度显著下降[1]。杨建香[15]研究发现，三丁酸甘油酯和包膜丁酸钠释放的丁酸具有抑制沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌增殖的作用，能够促进乳酸菌等有益菌生长，对预防产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎也具有一定功效。本研究发现，沙蒿多糖+丁酸甘油酯组的效果优于沙蒿多糖+包被丁酸钠组，原因可能是丁酸甘油酯到达肠道作用位点的丁酸浓度高于包膜丁酸钠，相关作用原理有待进一步研究。本试验发现，试验2组羔羊空肠和回肠样品中Chao1指数、十二指肠、空肠和回肠样品中Shannon指数和Simpson指数均高于其他组，表明在日粮中添加沙蒿多糖组合制剂能够重新平衡肠道菌群，提高滩羊肠道菌群种类和改善微生物均匀性，增强滩羊对抗不良因素的能力。疣微菌门丰度的减少与宿主免疫力下降密切相关，在哺乳动物胃肠道免疫耐受中也发挥重要作用[16]。本研究中，与对照组相比，试验2组中滩羊回肠中疣微菌门的相对丰度显著提高，表明日粮中添加沙蒿多糖+丁酸甘油酯可能会增强机体免疫力。3.2沙蒿多糖组合制剂对滩羊肠道微生物区系在属水平上的影响在属水平上，瘤胃球菌属是普遍存在于草食动物胃肠道中主要的纤维降解菌，主要包括黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌，能够产生纤维水解酶，对降解粗饲料中纤维素和半纤维素起重要作用[17]。瘤胃球菌属UCG-014对肠道炎症的改善具有促进作用[18]。毛螺菌科与机体腹腔疾病和溃疡性结肠炎等疾病有关[19]。本试验中，试验1组和2组羔羊十二指肠和回肠中瘤胃球菌属UCG-014的相对丰度明显增加，试验1组和3组毛螺菌科NK3A20的相对丰度明显降低，但与对照组相比差异均不显著。沙蒿多糖及包被丁酸钠和丁酸甘油酯等丁酸衍生物能够抑制病原菌增殖，稳定肠道菌群[1,15]，联合添加后具有维持动物肠道微生物平衡的协同作用，改善肠道微生物多样性与菌群丰度，维持肠道健康。本试验发现，试验1组和2组羔羊回肠中瘤胃球菌属_UCG-005和瘤胃球菌属_UCG-014的相对丰度高于试验3组，而瘤胃球菌属的相对丰度低于试验3组。原因可能是添加莫能菌素使回肠内瘤胃球菌属的生长受到抑制，从而使与其存在竞争关系的其他瘤胃球菌属的丰度相对提高[20]。本试验仅列出了部分具有较高（高于1%）相对丰度门水平和属水平的微生物群落，这部分微生物群落被称为主要胃肠道细菌，但在反刍动物胃肠道中，相对丰度较低（低于1%）的微生物群落无法直接被认为是功能性或重要性较小的微生物群落。因此，需进一步探究上述微生物种属在胃肠道中的作用。4结论日粮中添加沙蒿多糖组合制剂可提高滩羊羔羊肠道菌群多样性，改善肠道微生物区，以沙蒿多糖+包被丁酸钠组和沙蒿多糖+丁酸甘油酯效果较好。