微生态制剂是基于微生态原理，将对机体有益的益生菌及其代谢产物等活性物质经过特殊加工工艺而制成的生物制品，又称为活菌制剂[1]。复合活菌制剂主要由两种或两种以上具有不同生物功能的益生菌组合，通过生物拮抗、生物夺氧及增强免疫等作用以维持动物胃肠道内环境平衡。益生菌在动物机体内生长代谢所产生的各种消化酶能够明显加强机体对饲料中各种营养成分的消化吸收，提高饲料的利用率[2]。微生态制剂能够改善畜禽机体免疫性能，提高畜禽抗病能力，具有低残留、无抗药性等优点，在畜牧生产中广泛应用，是一种理想的替抗饲料添加剂[3-5]。微生态制剂可以提高仔猪的成活率，预防仔猪发生腹泻和呼吸道疾病，有效降低断奶应激、饲料应激、环境应激等，促进仔猪生长发育[6]。本研究选用实验室分离、鉴定的猪源乳酸杆菌、酪酸梭菌和枯草芽孢杆菌等益生菌菌株，通过仔猪饲喂试验评估其临床使用效果，为复合益生菌在仔猪生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1益生菌株益生菌株由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院微生物研究室分离鉴定。在齐齐哈尔周边地区猪场选定1~30日龄纯种长白、纯种大白、纯种杜洛克、二元及三元健康仔猪，采集新鲜粪样，置于灭菌采样杯中，冷藏，送至实验室进行细菌分离。通过安全性试验、抑菌试验、耐酸试验及温度敏感性等试验，从分离的菌株中筛选出无致病性且对不良环境等因素耐受力强的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、酪酸梭菌、枯草芽孢杆菌各1株。嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌前期已优化，故本研究中只优化酪酸梭菌。1.1.2试验动物试验35 d仔猪由拜泉县海霞生猪饲养有限责任公司提供，母系父系均为长白猪，仔猪的免疫按猪场常规免疫程序进行，断奶仔猪饲喂猪场的全价配合饲料。1.1.3培养基MRS培养基、营养肉汤培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司。1.2测定指标及方法1.2.1酪酸梭菌培养工艺研究采用单因素法分别对培养温度、培养液初始pH值、接种量、装液量等培养条件进行优化，从而确定酪酸梭菌的最佳培养工艺。取活化后的酪酸梭菌菌株，以2%的接种量（约1.0×l06 CFU/mL）接种装有150 mL培养基的250 mL锥形瓶，分别在36、37和38 ℃条件下厌氧静止培养24 h，波长600 nm处测定吸光值，以确定培养温度。取活化后的酪酸梭菌菌株，以2％的接种量（约1.0×l06 CFU/mL）接种至装有150 mL培养基的250 mL锥形瓶，培养基初始pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，接种后置于37 ℃厌氧静止培养24 h，波长600 nm处测定吸光值，以确定培养基pH值。取活化的酪酸梭菌菌株，接种装有150 mL培养基的250 mL锥形瓶，接种量分别为1％、2％、3％、4％、5％，置于37 ℃厌氧环境静止培养24 h，在波长600 nm处测定吸光值，以确定接种量。取活化后的酪酸梭菌菌株，以2％的接种量（约1.0×l06 CFU/mL）分别接种装有20％、30％、40％、50％、60％培养基的250 mL锥形瓶中，37 ℃厌氧静止培养24 h，在波长600 nm处测定吸光值，以确定装液量。1.2.2复合益生菌制剂的制备取各菌株活化，分别进行一级、二级种子液制备。取制备的二级种子液分别接种于发酵罐，进行液体深层发酵培养，待活菌数达109 CFU/mL时，取发酵液进行离心，浓缩，喷雾干燥，活菌数检验等程序，制备各益生菌制剂。将各益生菌制剂按1∶1∶1∶1比例进行复配，制备复合益生菌制剂，包括液体制剂和粉状制剂。液体制剂成品中益生菌活菌总数达1.0×109 CFU/mL以上，粉状制剂成品中益生菌活菌总数达1.0×1012 CFU/g以上。1.3仔猪饲养试验1.3.1试验设计选择35日龄健康断奶仔猪180头，随机分成3组，每组设3个重复，每个重复20头。试验1组仔猪饮水饲喂1.0×108 CFU/(头·d)液态制剂，试验2组仔猪拌料饲喂1.0×108 CFU/(头·d)粉状制剂，对照组不添加制剂。试验期2周。1.3.2测定指标及方法1.3.2.1生长性能试验第1 d和最后1 d，仔猪空腹12 h，称重，测定各试验组仔猪初重、末重，计算平均日增重。试验期内记录每天每组投料量和剩料量，计算平均日采食量及料重比。记录每天各组猪出现腹泻的头数和次数，计算腹泻率。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=(投料量-剩料量)/每组头数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)腹泻率＝腹泻总次数/(试验天数×试验头数)×100%(4)1.3.2.2肠道菌群每个重复选取1头猪，试验最后1 d饲喂1 h后，用灭菌肛拭子伸入肛门，无菌采集直肠末端新鲜粪球2~5 g于灭菌粪便采样杯中，置于冰盒，整个采样过程在1 h内完成。低温条件下送回实验室进行细菌计数，超净台中取粪样0.5~1.0 g，加入10倍质量的灭菌生理盐水，混匀，10倍梯度稀释，自10-1~10-9，共9个稀释度。乳酸菌和酪酸梭菌在MRS琼脂培养基上厌氧培养，大肠杆菌在麦康凯琼脂培养基培养。细菌计数采用平板计数法进行统计[7]。1.4复合益生菌制剂对仔猪腹泻的治疗试验1.4.1试验设计试验选择28日龄腹泻仔猪27头，随机分为3组，每组3个重复，每个重复3头猪。试验1组腹泻仔猪采用1.0×109 CFU/(头·d)液态制剂治疗，试验2组腹泻仔猪采用1.0×109 CFU/(头·d)粉状制剂治疗，对照组腹泻仔猪采用抗生素治疗。试验期3 d。1.4.2仔猪腹泻有效率和治愈率记录试验猪健康和腹泻状况，计算有效率和治愈率。治愈：投药3 d内仔猪的腹泻症状有所缓解或完全消失，粪便恢复正常。有效果：投药3 d内仔猪的腹泻症状有所缓解，腹泻次数减少。无效果：投药3 d内仔猪的腹泻症状毫无改善，甚至情况越来越差，腹泻的次数越来越多。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 17.0统计分析软件进行单因素方差分，LSD法多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1酪酸梭菌培养工艺研究（见表1~表4）由表1可知，在37 ℃培养条件下，酪酸梭菌培养液OD600 nm值为0.942，高于其他培养温度的OD600 nm值，表明37 ℃最适于酪酸梭菌生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.007.T001表1不同温度条件下菌株培养液OD600 nm值温度36 ℃37 ℃38 ℃结果0.5650.9240.438由表2可知，在初始pH值6.5条件下，酪酸梭菌培养液OD600 nm值为0.908，高于其他pH值培养条件下的OD600 nm值，表明培养基初始pH值为6.5时最适于酪酸梭菌生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.007.T002表2不同pH值条件下菌株培养液OD600 nm值pH值5.56.06.57.07.5结果0.7580.8590.9080.8960.852由表3可知，在接种量为3%时酪酸梭菌培养液OD600 nm值为0.973，高于其他接种量时培养液OD600 nm值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.007.T003表3不同接种量条件下菌株培养液OD600值接种量1%2%3%4%5%结果0.0710.7500.9730.8790.771由表4可知，在装液量60%时酪酸梭菌菌株培养液OD600 nm值为0.906，高于其他装液量时培养液OD600 nm值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.007.T004表4不同装液量条件下菌株培养液OD600 nm值装液量20%30%40%50%60%结果0.6760.7220.8200.8630.9062.2复合益生菌制剂对断奶仔猪生长性能及腹泻影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，试验组仔猪平均日增重分别升高了7.12%和11.30%（P0.05），料重比分别降低了5.67%和2.84%（P0.05）；与对照组相比，试验组仔猪腹泻发病率分别降低63.8%和53.3%（P0.05）。试验1组仔猪腹泻率低于试验2组（P0.05）。与对照组相比，试验组仔猪肠道乳酸菌数量分别提高21.2%和25.7%（P0.05），大肠杆菌数量分别降低8.28%和9.19%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.007.T005表5复合益生菌制剂对断奶仔猪生长性能、腹泻及肠道菌群的影响项目试验1组试验2组对照组初重/kg6.04±1.226.05±0.986.04±1.36末重/kg10.25±1.26ab10.42±0.90a9.97±1.40c平均日增重/[g/(头·d)]301.0±21.0ab312.0±14.0a281.0±18.0c平均日采食量/[g/(头·d)]403±16b428±28a396±12bc料重比1.33±0.40bc1.37±0.60b1.41±0.20a腹泻率/%7.6±0.3c9.8±0.4b21.0±1.3a乳酸菌数/lgCFU/g8.57±0.08ab8.89±0.17a7.07±0.23c大肠杆菌数/lgCFU/g6.09±0.38b6.03±0.65bc6.64±0.35a注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.3复合益生菌制剂对仔猪腹泻的治疗效果（见表6）由表6可知，对照组仔猪腹泻治疗的有效率和治愈率均显著高于试验组（P0.05），试验1组和试验2组仔猪腹泻治疗有效率均达到70％以上，治愈率可达到55％以上。研究表明，复合益生菌制剂具有治疗仔猪腹泻的效果，且液态制剂治疗效果优于粉状制剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.007.T006表6复合益生菌制剂治疗仔猪腹泻率的效果组别有效率治愈率试验1组80.0±3.2b62.0±2.4b试验2组73.0±4.1c56.0±1.7bc对照组96.0±2.8a88.0±2.2a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%3讨论3.1酪酸梭菌培养工艺优化分析酪酸梭菌也称为丁酸梭菌，2009年7月，农业农村部批准丁酸梭菌加入饲料添加剂使用名录，正式进行工业生产和临床使用[8]。酪酸梭菌分泌的酪酸是肠黏膜的主要能量，可修复受损肠黏膜，促进双歧杆菌和乳酸菌等益生菌生长，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌生长，维持肠道菌群平衡[9]。酪酸梭菌可将食物中的多糖分解为低聚糖，促进肠道其他有益菌快速生长；酪酸梭菌产生的丁酸、乙酸等短链脂肪酸能够降低肠道pH值，从而抑制有害菌的附着和繁殖[10]。酪酸梭菌在外界环境不利于生存时能够产生芽孢，可耐受胃液、胆汁酸和消化液[11-12]，抗逆性强。酪酸梭菌对多种抗生素具有较强的耐受性，在临床上可与抗生素联合使用[13]。酪酸梭菌是严格厌氧菌，不同菌株在不同培养基配方条件下的最佳培养条件不同。邢宏观[14]以可溶性淀粉2%、酵母浸粉6%、硫酸亚铁1.74%、磷酸氢二钾0.37%、氯化钠0.2%、硫酸镁0.024%为最佳培养基组分，优化得到最佳培养条件：温度34 ℃、培养基初始pH值7.0、接种量4%，优化后菌体数比优化前提高了4.39倍。余国莲等[15]采用单因素试验和正交试验研究丁酸梭菌DS培养条件，发现培养条件为培养基pH值7.3、温度37 ℃、培养24 h、接种量3%；最适培养基成分为葡萄糖10 g、豆粕15 g、玉米粉7 g、硫酸镁0.2 g、硫酸铵0.2 g、磷酸氢二钾0.5 g、磷酸二氢钾0.5 g、碳酸钙0.3 g、蒸馏水1 000 mL。蒋维勇[16]对丁酸梭菌BJ-10培养条件进行优化，最佳的产菌条件为葡萄糖3%、酵母膏2.99%、碳酸钙0.5%、氯化钠0.5%、氯化钾0.3%、接种量1%、发酵时间24 h、培养温度为30 ℃、培养基初始pH值7.95。本试验中，使用MRS培养基进行培养，优化后的最佳培养条件为温度37 ℃、培养24 h、培养基初始pH值6.0、接种量3％、装液量60％。3.2复合益生菌制剂对断奶仔猪生长性能及腹泻的影响早期断奶而引起的环境、日粮、管理等应激会导致仔猪产生断奶应激综合征，对仔猪生长发育、机体免疫力及健康状况产生不良影响，导致仔猪腹泻、生长缓慢、抵抗力下降等[17-18]。目前仔猪腹泻仍是养猪生产中的难题，生产中普遍采用添加高剂量氧化锌预防仔猪腹泻，促进仔猪生长[19]。但氧化锌只有5%~10%的生物利用率，大部分从粪尿中排出，会对环境造成严重污染，不利于养殖业持续、健康发展[20-22]。微生态制剂对降低仔猪腹泻、提高仔猪生长性能均具有良好的效果。研究表明，饲粮中添加0.3%的由酿酒酵母和枯草芽孢杆菌（5×108 CFU/g）组成的复合益生菌可显著提高断奶仔猪试验期末重和平均日增重，显著降低料重比和腹泻率，且血清中肿瘤坏死因子-α含量显著降低，谷胱甘肽过氧化物酶、谷草转氨酶活性显著升高[23]。庞敏等[24]在日粮中添加0.05%的酪酸梭菌（1×1010 CFU/g）可显著降低断奶仔猪腹泻率，改善肠黏膜形态，降低肠黏膜通透性，上调紧密连接蛋白的表达量，从而保护肠道黏膜屏障功能，减弱早期断奶应激引起的不利影响。吕翠等[25]使用乳酸菌类和酵母菌类益生菌治疗腹泻仔猪，益生菌制剂治疗组的平均疗程为4 d，治愈率为83.3%，总有效率达100%；庆大霉素治疗组平均疗程5 d，治愈率为50%，无效率为22.2%，总有效率为72.2%；与庆大霉素治疗效果相比，益生菌制剂的治疗效果明显优于庆大霉素。白雅琦[26]在育肥猪日粮中添加益生菌可显著提高试验猪粪便乳杆菌属的丰度，降低大肠杆菌志贺菌属的丰度。4结论本试验在断奶仔猪饲粮中添加乳杆菌、酪酸梭菌和枯草芽孢杆菌复合制剂，可提高仔猪生长性能，防治仔猪腹泻。