菌渣（糠）是指在栽培食用菌的过程中收获产品后剩余的废弃培养基料[1-2]。我国是食用菌生产和消费大国，2016年全国食用菌产量占全球产量70%以上，并产生至少约1 200万t菌渣[3]。菌渣中含有水分、菌丝和剩余营养物质，极易腐烂发臭，直接排放不仅对环境造成严重污染，还会造成资源浪费。研究表明，菌渣中残留大量菌丝，而菌丝中含有粗蛋白等营养物质[4]。因此，菌渣作为畜禽饲料加工原料具有较高的开发价值和广阔的应用前景。但菌渣中蛋白质含量偏低且纤维含量较高，导致饲用价值较低，无法直接喂养家畜[5]。菌渣进行固态发酵能够极大提高菌渣的饲用营养价值，可以实现食用菌渣大规模资源化利用，缓解蛋白饲料短缺[6]。发酵前醋糟菌渣中粗蛋白质9.85%、粗纤维30%、粗灰分16.35%，而发酵处理后的粗蛋白质含量提高至24.94%、粗纤维含量下降至5.07%、粗灰分含量为13.04%[7]。利用食用菌渣进行固态发酵以生产蛋白饲料的研究现已较为广泛[8-10]。但在发酵菌种选择多集中于单一菌种，而对混合菌发酵研究相对较少。本试验拟以金针菇菌渣为研究对象，采用单因素试验和正交试验分析法，研究不同因素（发酵温度、料液比、发酵时间和种子液接种量）对固态发酵食用菌渣中粗蛋白含量的影响，寻找最优发酵工艺参数，比较发酵前后营养物质的含量差异，为固态发酵食用菌渣生产蛋白饲料的工艺优化提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1主要试剂金针菇食用菌生产后废弃的固态菌渣（菌糠）由安阳博利农业科技有限公司提供。小麦麸皮购自石家庄仙科庭农业科技有限公司。黑曲霉菌（1.0×109 CFU/mL）、枯草芽孢杆菌（1.0×109 CFU/mL）和热带假丝酵母（0.5×109 CFU/mL）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏号分别为CICC40384、CICC25064和CICC1254。葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸铵由上海远慕生物科技有限公司提供，酵母抽提物、琼脂、胰蛋白胨由广东环凯微生物科技有限公司提供。其余化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。1.1.2主要仪器Cubis® Ⅱ型模块化电子天平（上海金畔生物科技有限公司）、MBC-4V6084℃型冷藏箱（安徽中科都菱商用电器股份有限公司）、Aeolus V型超净台（上海开陌实验器材有限公司）、WH-25型恒温培养箱（德国WIGGENS）、WH-15型恒温培养箱（德国WIGGENS）、TL2020型实验室小型植物粉碎机（鼎昊源生物科技有限公司）。1.2测定指标及方法1.2.1菌种活化及种子液制备参考孙雪颖[11]的方法，利用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基对黑曲霉进行菌种活化及制备种子液。培养基组成为：自提马铃薯浸取液1.0 L、葡萄糖20.0 g和琼脂18.0 g，pH值约6.0~6.5。菌种活化：在PDA培养基中接种黑曲霉原种，30 ℃恒温培养活化72 h。种子液培养基：果胶10 g/L、酵母膏10 g/L、氯化钠2 g/L、磷酸二氢钾0.3 g/L、磷酸氢二钾1 g/L和硫酸镁0.3 g/L，pH值约6.0~6.5。采用10 mL无菌水冲洗斜面培养基，接种至盛有75 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、160 r/min恒温振荡培养72 h，制得种子液。参考焉兆萍等[12]的方法，利用LB固体培养基对枯草芽孢杆菌进行菌种活化及制备种子液。培养基组成为：蛋白胨10 g、琼脂20 g、葡萄糖5 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g和水1.0 mL，pH值约7.0。菌种活化：在LB固体培养基中接种枯草芽孢杆菌，37 ℃恒温培养活化18 h。种子液培养基：蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g和水1.0 mL，pH值约7.0。从LB固体培养基上挑取单菌落，接种至盛有75 mL LB液体种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min振荡培养24 h，制得种子液。参考王普等[13]的方法，对热带假丝酵母进行菌种活化及种子液制备。斜面培养基组分：葡萄糖12.0 g、酵母粉3.5 g、蛋白胨4.5 g、琼脂18.0 g、蒸馏水1.0 L，pH值自然。菌种活化：在斜面培养基上接种热带假丝酵母，30 ℃恒温培养活化96 h。种子液培养基：葡萄糖30.0 g/L、酵母粉6.0 g/L、氯化铵 6.0 g/L、七水合硫酸镁0.5 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L，pH值自然。在250 mL三角瓶中，将斜面种子接种到75 mL液体种子培养基中，30 ℃恒温摇床200 r/min振荡培养24 h，制得种子液。将配制好的固体和液体培养基121 ℃灭菌20 min。采用显微镜镜检孢子的方式，待种子液中菌体孢子数量超过1.0×108 CFU/L时冷藏。参考文献[10]、文献[14]，以1∶3∶2比例将黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母种子液混合。1.2.2菌体蛋白饲料发酵工艺流程将新鲜的菌渣溶胀，碎解，采用植物纤维分解机进行湿磨处理，将菌渣破碎，软化成浆。将麸皮∶菌渣按照2∶8（g/g）[10]，料液比1∶1 g/mL比例加入蒸馏水，调节固态发酵培养基水分含量，充分混合均匀，称取物料200 g于250 mL三角瓶中，瓶口覆盖透气性胶塞，121 ℃灭菌25 min，制成菌渣发酵培养基。待菌渣发酵培养基冷却，以10%质量分数接种黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母的混合种子液（活菌数1.0×108 CFU/L），置于30 ℃恒温培养箱中72 h。培养结束，将培养物置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎，用于检测粗蛋白含量。1.2.3发酵条件的单因素试验设计以1.2.2中所述的发酵工艺流程为初始条件，考察发酵温度（24、27、30、33、36 ℃）、料液比（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/mL）、发酵时间（24、48、72、96、120 h），种子液接种量（5%、10%、15%、20%、25%）对固态发酵食用菌渣生产蛋白饲料的影响，每个处理3次重复。1.2.4发酵工艺优化的正交试验设计在上述1.2.3单因素试验基础上，筛选各因素最佳范围后，设计4因素3水平，L9（34）正交试验设计见表1。以发酵温度（℃）、料液比（mL/g）、发酵时间（h）和种子液接种量（%）为考察对象，粗蛋白含量为指标，确定优化固态发酵食用菌渣生产菌体蛋白的最佳工艺条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.017.T001表1L9（34）正交试验设计水平A发酵温度/℃B料液比/(g/mL)C发酵时间/hD种子液接种量/%1272.072152302.596203333.0120251.2.5粗蛋白及其他营养成分含量测定利用1.2.4中正交试验分析结果，在最优的工艺组合条件下再进行发酵。以未发酵样品为对照，比较最优工艺下，发酵前后食用菌渣中各营养物质含量。取发酵前菌渣、发酵后培养物各10 g，50 ℃烘箱中烘干，粉碎，过40目筛。分别测定粗蛋白、纤维素、半纤维素、木质素和粗灰分的含量。随机从发酵前的金针菇菌渣中取5 g样品，检测其粗蛋白含量，设6个平行。粗蛋白含量测定参照国际标准AOAC（2005）采用凯氏定氮法进行。纤维素、半纤维素、木质素含量测定参照农业农村部发布《农业生物质原料 纤维素、半纤维素、木质素测定》（NY/T 3494—2019）进行检测，其中纤维素和半纤维素含量采用高效液相色谱法测定，木质素采用紫外分光光度法测定。粗灰分含量采用高温灼烧法进行测定[15]。1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1发酵前金针菇菌渣中粗蛋白含量（见表2）由表2可知，该菌渣中平均粗蛋白含量为10.56%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.017.T002表2发酵前金针菇菌渣中粗蛋白含量项目123456平均值含量10.6910.4310.999.9610.5010.7610.56%2.2单因素试验结果2.2.1发酵温度对发酵菌渣中粗蛋白含量的影响（见图1）由图1可知，随着发酵温度升高，发酵后产物中粗蛋白含量呈先升高后下降的趋势。当发酵温度升高到30 ℃时，粗蛋白含量达到最高，为19.15%。发酵温度27 ℃和33 ℃的粗蛋白含量与30 ℃组相近，分别为16.25%和17.64%。因此，发酵温度选择27、30、33 ℃用于后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.017.F001图1发酵温度对发酵菌渣中粗蛋白含量的影响2.2.2料液比对发酵菌渣中粗蛋白含量的影响（见图2）由图2可知，随着料液比的提高，即随着发酵底物中物料的增多，发酵后产物中粗蛋白含量呈现快速升高的趋势，但当料液比达3.0时，粗蛋白含量反而明显下降。当料液水比为2.5时，粗蛋白含量达到最高，为18.82%。料液比2.0和3.0的粗蛋白含量略低于2.5，分别为17.51%和16.69%。因此，料液比选择2.0、2.5和3.0 mL/g用于后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.017.F002图2料液比对发酵菌渣中粗蛋白含量的影响2.2.3发酵时间对发酵菌渣中粗蛋白含量的影响（见图3）由图3可知，随着发酵时间的延长，发酵后产物中粗蛋白含量呈现快速升高后逐渐平稳的趋势。当发酵时间达96 h时，粗蛋白含量最高，为18.88%。发酵120 h仅比96 h低0.49%；72 h的粗蛋白含量仅次于96 h和120 h。因此，发酵时间选择72、96和120 h用于后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.017.F003图3发酵时间对发酵菌渣中粗蛋白含量的影响2.2.4种子液接种量对发酵菌渣中粗蛋白含量的影响（见图4）由图4可知，随着种子液接种量提高，发酵后产物中粗蛋白含量同样呈现快速升高后逐渐平稳的趋势。当种子液接种量为20%时，粗蛋白含量达到最高，为17.04%。种子液接种量25%仅比20%低0.61%；接种量15%的粗蛋白含量与20%和25%接近。因此，种子液接种量选择15%、20%和25%用于后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.017.F004图4种子液接种量对发酵菌渣中粗蛋白含量的影响2.3正交试验结果（见表3、表4）由表3、表4可知，在固态发酵食用菌渣生产蛋白饲料过程中，影响发酵后产物粗蛋白含量的4个因素，根据其R值大小判定各影响因素的重要性依次为：料液比发酵温度种子液接种量发酵时间。多因素方差分析结果显示，发酵温度、料水比、发酵时间和种子液接种量等因素对发酵后产物中粗蛋白含量均具有极显著影响（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.017.T003表3正交试验结果项目ABCD粗蛋白含量/%平行1平行2均值1111113.2613.6813.472123215.1915.2215.213132317.4117.1917.304213316.5916.9316.765222116.8416.7816.816231216.3716.6916.537312215.4815.2815.388321317.0516.9717.019333117.2817.6217.45K145.9745.6147.0147.73K250.1049.0349.4947.11K349.8451.2849.4151.07k115.3215.2015.6715.91k216.7016.3416.5015.70k316.6117.0916.4717.02R1.371.890.831.3210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.017.T004表4方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值截距4 731.37514 731.375139 774.7400.000**发酵温度7.11623.558105.1090.000**料水比10.86625.433160.4990.000**发酵时间2.65321.32739.1930.000**种子液接种量6.03923.02089.2040.000**残差0.30590.034注：1.R2=0.989；F0.05（2，9）=4.26，F0.01（2，9）=8.02。2.“**”表示影响极显著（P0.01）。综合极差分析和方差分析结果，各因素k值最大水平为最优参数，固态发酵食用菌渣生产蛋白饲料的最优工艺参数为：发酵温度30 ℃（k2）、料液比3.0 g/mL（k3）、发酵时间96 h（k2）和种子液接种量25%（k3）。2.4最优工艺发酵前后菌渣中各营养物质含量（见表5）根据正交试验结果，以发酵温度30 ℃、料液比3.0 g/mL、发酵时间96 h、种子液接种量25%，测定该发酵工艺条件下发酵后产物中粗蛋白及其他营养物质的含量，并与发酵前菌渣做比较。由表5可知，最优工艺条件下，发酵后菌渣中粗蛋白含量显著高于未发酵菌渣（P0.05），是发酵前含量的2.11倍；发酵后菌渣的纤维素和半纤维素含量显著降低（P0.05），分别比发酵前降低了16.90%和4.84%；木质素和粗灰分含量在发酵前后差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.017.T005表5最佳发酵参数条件下发酵前后营养物质含量项目发酵前菌渣发酵后菌渣粗蛋白10.56b22.37a纤维素27.49a10.59b半纤维素6.33a1.49b木质素28.4630.07粗灰分5.194.97注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%3讨论菌渣是栽培、收割食用菌后遗留的废弃培养基，但其中还含有食用菌菌丝残体以及经食用菌酶解后结构变化的粗纤维等成分，故菌渣中仍含有较为丰富的营养物质[16]。本试验结果表明，发酵前的固体菌渣中粗蛋白含量约为10.56%。但菌渣中蛋白质含量偏低且纤维含量较高，饲用价值较低，无法直接喂养家畜。因此，利用发酵技术将食用菌渣转化为蛋白饲料能够极大提高菌渣的饲用营养价值。本研究通过正交试验和极差分析，研究固态发酵食用菌渣在蛋白饲料的生产工艺中，影响产物粗蛋白含量的4个因素，影响粗蛋白含量的排序为：料液比发酵温度种子液接种量发酵时间。最优发酵工艺参数为：发酵温度30 ℃、料液比3.0 mL/g、发酵时间96 h和种子液接种量25%，此工艺条件下的发酵后产物中粗蛋白含量为22.37%。张婷婷[17]研究发现，影响菌渣发酵后产物中蛋白质含量的因素依次为基质配比、发酵时间、温度、料液比，其最优工艺条件为接种量13%（酵母菌），基质中麸皮质量分数20%、料液比为1∶2.5 mL/g、30℃下发酵96 h。本研究结果与上述结论不一致，可能是由于不同研究所使用的菌渣来源、发酵菌种类型和生产流程细节等有所不同。本研究中，多因素方差分析结果显示，发酵温度、料液比、发酵时间和种子液接种量等因素对发酵后产物中粗蛋白含量均具有极显著影响，表明在利用菌渣生产蛋白饲料的过程中，发酵时间、接种菌种数量（或类型）、发酵温度控制和基质中营养物质的浓度等均能够显著影响粗蛋白产量。因此在生产开始前，需对上述4个因素的水平设置进行充分考察。此外，使用响应面法进行进一步改进本研究，寻找更精细的优化参数。食用菌菌渣经发酵后，其产物的营养价值得到进一步改变，可作为一种优质的绿色饲料[18]。本研究表明，在最优发酵工艺条件下，菌渣发酵产物中粗蛋白含量显著高于未发酵菌渣，为22.37%，是发酵前菌渣含量（10.56%）的2.11倍；发酵产物纤维素和半纤维素含量显著降低，分别为10.59%和1.49%，比发酵前降低了16.90%和4.84%。杨丽华等[19]利用混菌对白酒酒糟进行固态发酵制作蛋白饲料，结果显示，发酵后72 h，产物中的酵母菌活菌数达到6.98×109个/g，而粗蛋白质含量比较发酵前提高了60.43%。本研究结果与上述研究结果相同，表明利用混菌对食用菌渣进行固态发酵，可生产较优质的蛋白饲料，有效提高菌渣的附加经济效益和饲用营养价值。固态发酵食用菌渣生产蛋白饲料具有广泛的用途和应用前景。4结论本研究结果显示，在固态发酵食用菌渣生产蛋白饲料过程中，影响发酵后产物中粗蛋白含量因素的排序为：料液比发酵温度种子液接种量发酵时间。最优发酵工艺参数为：发酵温度30 ℃、料液比3.0 g/mL、发酵时间96 h和种子液接种量25%。此工艺条件下的发酵后产物中粗蛋白含量为22.37%。与发酵前营养物质含量相比，发酵后产物中粗蛋白含量显著提升，纤维素和半纤维素含量显著降低。因此，利用混菌对食用菌渣进行固态发酵，可生产较优质的蛋白饲料，有效提高菌渣的经济效益和饲用营养价值。