马齿苋为马齿苋科马齿苋属一年生野生肉质草本植物，其生物活性成分主要有多糖、萜类、有机酸、多巴胺等[1]。马齿苋的饲用价值极高，能够改善动物的生产性能，降低料重比，调节胃肠功能[2]。马齿苋多糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖等单糖组成，具有抗氧化[3]、降血糖[4]、调节机体免疫力[5]、抑菌[6]、抗肿瘤[7]、抗癌等[8-9]生理功能。马齿苋多糖可有效提高雏鸡和仔猪的日增重，降血脂、抗猪流行性腹泻病毒、增强畜禽免疫力[10-11]。超声波法是利用其机械效应、机械剪切作用及空化作用破碎原材料，利于细胞内的有效成分扩散和溶出[12]。酶法提取多糖使植物细胞壁及组织快速降解[13]。钱志伟等[14]和胡庆娟等[15]分别采用纤维素酶和木瓜蛋白酶提取马齿苋多糖。超声波-复合酶协同提取法具有提取效率高、提取时间短、操作简单等优点。辛明等[16]使用超声波-复合酶提取圣女果皂苷。秦令祥等[17]使用超声波-复合酶提取香菇多糖，但目前没有超声波-复合酶在新鲜马齿苋中提取多糖的研究。本研究以新鲜马齿苋为原料，采用超声波-复合酶法协同提取优化马齿苋多糖的提取工艺，旨在为新鲜马齿苋作为饲料添加剂的研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料新鲜马齿苋全株于自盛花期采摘，采自福建省福州地区，经福建中医药大学中药鉴定教研室鉴定确认。木瓜蛋白酶（60 000 U/g）、纤维素酶（50 000 U/g）购自上海阿拉丁化学试剂公司；其余试剂均为国产AR级。1.2试验仪器UV-1800PC DS2紫外可见光分光光度计（上海美普达仪器有限公司）、DS-1高速组织捣碎机（上海精科实业有限公司）、AL 204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）、SHA-B恒温振荡器（常州国华电器有限公司）、101A-2电热鼓风恒温干燥箱（上海东星建材试验设备有限公司）。1.3测定指标及方法1.3.1马齿苋多糖提取液制备取新鲜马齿苋适量，清洗，60 ℃热风干燥24 h，粉碎，过40 目筛，加入乙醚脱脂，得马齿苋粉末。精密称取马齿苋粉末2.000 g，置于具塞锥形瓶，按照液料比30 mL/g加入蒸馏水，160 W功率下超声提取40 min取出。按照1.8∶1质量比加入纤维素酶和木瓜蛋白酶40 mg，调整pH值至4.5，50 ℃酶解50 min，加热至100 ℃，保持5 min以钝化酶的活性，过滤，得到马齿苋多糖提取液，4 ℃冰箱保存。1.3.2马齿苋多糖的单一超声波法提取精确称取马齿苋粉末2.000 g，置于具塞锥形瓶，按照液料比31 mL/g加入蒸馏水，超声功率160 W处理 40 min，真空抽滤，定容至100 mL，测定超声波提取马齿苋多糖的提取率。1.3.3马齿苋多糖含量采用苯酚-硫酸法测定新鲜马齿苋中多糖含量[18]。参考文献[19]计算马齿苋多糖提取率。马齿苋多糖提取率=多糖质量/马齿苋粉末质量(1)1.3.4超声波-复合酶法协同提取马齿苋多糖的工艺优化1.3.4.1单因素试验以多糖提取率为评价指标，分析液料比（10、20、30、40、50 mL/g）、超声时间（20、30、40、50、60 min）、超声功率（80、120、160、200、240 W）、加酶比（纤维素酶：木瓜蛋白酶）（0.6∶1、1∶1、1.4∶1、1.8∶1、2.2∶1）、酶解时间（30、40、50、60、70 min）对多糖提取率的影响。1.3.4.2响应面优化试验设计（见表1）依据单因素预试验结果，选取马齿苋多糖提取率为响应值，使用Box-Behnken Design对液料比（A）、超声功率（B）、加酶比（C）、酶解时间（D）进行拟合设计。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.T001表1响应面因素水平设计水平A/(mL/g)B/WCD/min-1201201.4∶1500301601.8∶1601402002.2∶1702结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1液料比对马齿苋多糖提取率的影响（见图1）由图1可知，马齿苋多糖提取率随液料比增加而增加。当液料比为30 mL/g时，多糖提取率最高，为21.02 mg/g。在液料比为10~30 mL/g时，可增加多糖与溶剂的接触面，利于多糖溶出，提取率不断增大。而液料比大于30 mL/g时，多糖溶出率基本饱和，提取率趋于平稳。因此，后续试验选取液料比为30 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.F001图1液料比对马齿苋多糖提取率的影响2.1.2超声时间对马齿苋多糖提取率的影响（见图2）由图2可知，20~40 min马齿苋多糖提取率与超声时间呈线性增长关系。当超声时间为40 min，多糖提取率达到最大，为21.12 mg/g；之后随超声时间的增加多糖提取率反而有所减少。原因是超声作用时溶液内部会产生较多的热能，作用时间越长，聚集的热能也越多，当热能超过一定界限时，会破坏多糖的分子结构，使多糖提取率降低[20]。因此40 min是超声波的最佳提取作用时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.F002图2超声时间对马齿苋多糖提取率的影响2.1.3超声功率对马齿苋多糖提取率的影响（见图3）由图3可知，马齿苋多糖提取率随超声功率增加而增加，当超声功率为160 W时，马齿苋多糖提取率达到最大值，继续增大超声功率，马齿苋多糖提取率反而下降。因此，超声功率太小，多糖得不到充分提取，超声功率太大，可能破坏多糖成分，使多糖的提取率有所降低[21]。因此，选择超声功率在160 W左右为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.F003图3超声功率对马齿苋多糖提取率的影响2.1.4加酶比对马齿苋多糖提取率的影响（见图4）由图4可知，多糖提取率随着加酶比（纤维素酶：木瓜蛋白酶）的增加而不断提高，当加酶比达到1.8∶1时，多糖提取率达到最大值；继续增加加酶比至2.2∶1时，马齿苋多糖提取率变化不大。因此，选择加酶比1.8∶1~2.2∶1进行下一步优化试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.F004图4加酶比对马齿苋多糖提取率的影响2.1.5酶解时间对马齿苋多糖提取率的影响（见图5）由图5可知，马齿苋多糖提取率与酶解时间呈线性增长关系，但马齿苋多糖提取率在酶解时间50 min后基本保持不变。因此在50 min时，酶解反应已经比较完全，导致多糖提取率基本不再增加。因此，选择酶解时间为50 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.F005图5酶解时间对马齿苋多糖提取率的影响2.2响应面优化试验结果（见表2、表3）利用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行二次响应面分析、拟合，得到回归方程为：多糖提取率（Y）=20.93-0.11A-0.18B+0.079C-0.078D-0.020AB+0.032AC+0.12AD-0.11BC+0.31BD-0.030CD-0.43A2-0.79B2+0.15C2+0.035D2。由表3可知，回归模型对马齿苋多糖得率的影响达到极显著水平（P0.000 1），失拟项P=0.145 30.05，失拟项不显著，模型选用合理；模型的相关指数R2=0.982 4，表明该回归模型具有较好的拟合效果及良好的代表性；模型的校正决定系数R2Adj=0.964 8，使用该模型可解释96.48%的多糖得率的变化，表明该回归模型能够准确预测实际值，试验误差小，可用于分析和预测超声波-复合酶法协同提取马齿苋多糖的流程和工艺优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.T002表2响应面试验结果试验号ABCD多糖提取率/(mg/g)10-10120.022000020.763010-119.864-1-10019.595-101020.966011019.637010120.088-10-1020.639000021.12101-10019.32110-11020.7812001-121.2313001121.071400-1-120.961510-1020.4316000020.6917-100-120.7418110019.6719101020.8920000020.9321100120.54220-1-1020.692301-1019.9824100-120.2625-110020.0226000021.14270-10-121.0628-100120.542900-1120.9210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.T003表3马齿苋多糖提取率二项式回归模型的方差分析项目平方和自由度均方F值P值模型6.800 0140.490 047.0000.000 1A0.160 010.160 015.1030.000 1B0.410 010.410 0397.0010.000 1C0.075 010.075 017.3200.000 1D0.074 010.074 07.1040.000 1AB0.012 110.012 10.0150.000 1AC0.032 510.032 50.0410.046 7AD0.058 010.058 00.5600.084 3BC0.048 010.048 00.4700.050 5BD0.403 010.403 03.8400.070 3CD0.012 510.012 50.0350.085 5A21.180 011.180 011.4100.045 3B24.030 014.030 038.9400.000 1C20.140 010.140 01.3400.026 7D20.823 010.823 00.0760.078 7残差1.450 0140.100 0失拟项1.280 0100.130 03.070.145 3注：1.P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.R2=0.982 4，R2Adj=0.964 8。由P值可知，A、B、C、D、AB、B2均达到极显著水平。各因素对马齿苋多糖提取率影响为超声功率最大，加酶比和液料比次之，酶解时间的影响最小。各因素交互作用对马齿苋多糖提取率的影响见图6。图6各因素交互作用对马齿苋多糖提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.F6a1（a）液料比和超声功率对多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.F6a2（b）超声功率和加酶比对多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.015.F6a3（c）加酶比和酶解时间对多糖得率的影响由图6可知，超声功率和液料比、酶解时间和加酶比、加酶比和超声功率等因素之间均具有较大的交互作用，其中超声功率和液料比之间的交互作用显著，与表3中马齿苋多糖提取率二项式回归模型方差分析的结论一致。2.3验证试验通过Design-Expert 8.0.6软件对二项式模型进行预测，超声波-复合酶法协同提取马齿苋多糖的最佳工艺参数为：液料比30.91 mL/g、超声功率160.15 W、加酶比（纤维素酶、木瓜蛋白酶）2.24∶1、酶解时间50.96 min。在此条件下，马齿苋多糖提取率的理论值可达21.269 1 mg/g。考虑试验的可操作性，将最优工艺条件修正为液料比31 mL/g、超声功率160 W、加酶比（纤维素酶∶木瓜蛋白酶）2.2∶1、酶解时间51 min。在最优条件下做3次平行试验，得到马齿苋多糖提取率平均值为21.23 mg/g。实际测定值对理论值的相对误差为0.14%，表明本模型下可以取得较好的马齿苋多糖提取率。2.4单一超声波提取马齿苋多糖结果采用单一超声波提取马齿苋多糖作为对照试验，测得单一超声波提取马齿苋多糖的提取率仅为19.72 mg/g，明显低于超声波-复合酶法。3结论本试验通过单因素试验和Box-Behnken中心组合试验设计，得出超声波-复合酶法协同提取新鲜马齿苋中多糖化合物的最佳提取工艺条件为：液料比31 mL/g、加酶比(纤维素酶∶木瓜蛋白酶）2.2∶1、超声功率160 W、酶解时间51 min，马齿苋多糖提取率达21.23 mg/g。