饲用抗生素在提高畜禽抗病性、促进生长及改善饲养环境等方面具有良好效果，但抗生素具有潜在的致畸、致突变作用，存在引起过敏、毒性反应等风险，且致病菌耐药性增加了畜禽疾病的治疗费用和养殖成本[1-2]。此外，畜禽体内抗生素残留将严重威胁人类的健康[3-4]。因此，寻找高效、安全、无污染的新型抗生素替代物对于实现生态养殖，保障食品安全具有重要意义。连翘以果实入药，大量连翘叶被遗弃。连翘叶无明显毒性，其主要活性成分与药理作用与连翘果相似，具有抑菌、抗氧化、清除自由基、提高免疫力等多种功效[5-6]。连翘叶富含蛋白质、氨基酸、膳食纤维等营养物质，在预防和治疗畜禽疾病、促进动物生长等方面具有一定功效[7-9]。但将连翘叶直接应用于饲料中存在有效活性成分含量低，生物利用度低，不良气味重以及适口性差等缺点[10-11]。利用有益微生物发酵制备的中药微生态制剂则可避免上述缺陷。研究表明，微生物发酵可明显提高中药有效成分含量，促进活性成分转化，改善中药适口性，增加畜禽采食量[12]。中药微生态制剂作为一种理想的饲用抗生素替代物在预防和治疗动物疾病，提升畜禽生产性能，保障食品安全等方面具有广阔的应用前景。为提高连翘资源的综合利用率，满足畜禽养殖中对新型中药微生态制剂的需求，试验观察经枯草芽孢杆菌、乳酸菌等发酵制得的连翘叶微生态制剂对肉鸡生长性能、抗氧化能力、免疫指标及肠道微生物的影响，以期为连翘叶微生态制剂在肉鸡养殖中的推广应用提供参考。1材料与方法1.1试验动物健康1日龄白羽肉鸡购自山西省文水县大象禽业有限公司。1.2试剂与仪器连翘叶微生态制剂由山西中医药大学中药与食品工程学院实验室提供，活菌数≥5×108 CFU/g；饲用林可霉素购自宁波科瑞特动物药业有限公司。谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）及白细胞介素-10（IL-10）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。EMB琼脂平板、HE琼脂平板、LBS琼脂平板购自索莱宝生物科技有限公司。Allegra X-30R冷冻离心机（贝克曼公司）、Multiskan酶标仪（赛默飞公司）、TE3102S电子天平（赛多利斯公司）、Bactron EZ-2厌氧培养箱（Shellab公司）、HHS11-4恒温水浴锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）。1.3试验设计与饲养管理将300只健康的1日龄白羽肉鸡随机分为空白对照组、抗生素组以及连翘叶微生态制剂Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组，每组设3个重复，每个重复20只鸡。空白对照组饲喂基础日粮，抗生素组在基础日粮中添加100 mg/kg饲用林可霉素，各连翘叶微生态制剂组在基础日粮中分别添加1 000、2 000、4 000 mg/kg的连翘叶微生态制剂。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.010.T001表1基础日粮组成及营养水平项目1~21d22~42 d原料组成/%玉米57.5060.30麸皮3.204.00葵籽饼3.204.00棉仁饼5.606.00豆饼20.0018.00鱼粉6.005.00骨粉2.101.30贝壳粉2.001.00食盐0.200.20预混料0.200.20合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.3612.89粗蛋白质/%20.1719.46钙/%1.080.86总磷/%0.820.65有机磷/%0.660.45赖氨酸/%1.201.08蛋氨酸+半胱氨酸/%0.820.68注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 8 200 IU、VD3 2 000 IU、VE 25 mg、VB1 2.5 mg、VB2 10.0 mg、VB6 1.5 mg、VB12 0.1 mg、叶酸1.5 mg、生物素0.2 mg、烟酸40 mg、Cu 10 mg、Fe 60 mg、Zn 50 mg、Mn 60 mg、Se 0.2 mg、I 0.4 mg。2.营养水平均为实测值。各试验组肉鸡在试验期间定期进行常规疫苗免疫，自由采食、饮水，定期对周边环境和用具进行严格消毒处理，在完全相同试验条件下饲喂42 d。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能分别在1日龄、21日龄和42日龄对肉鸡进行空腹称重，计算试验期间各处理组的平均日增重；记录各处理组每日日粮消耗量，计算平均日采食量；根据各处理组平均日增重和平均日采食量，计算料重比。平均日采食量=饲料消耗量/试验天数(1)平均日增重=(末重-初重)/试验天数(2)料重比=饲料消耗量/增重量(3)1.4.2血清肝功能、抗氧化、免疫指标称重结束时，各重复中随机抽取5只肉鸡，每组共15只，翅下静脉采血2 mL，分离血清，-80 ℃保存。根据检测试剂盒说明书检测各处理组血清AST、ALT、SOD、GSH-Px、MDA、IgA、IgG、IgM、TNF-α、IL-6和IL-10等指标。1.4.3免疫器官指数采血后，将挑选的肉鸡颈静脉放血处死，迅速摘取胸腺、脾脏、法氏囊，擦干表面水分，称重并计算其免疫器官指数。器官指数=器官重量/活体重(4)1.4.4肠道菌群指标每个重复随机选取3只肉鸡，无菌采集盲肠内容物，加入无菌生理盐水振荡混匀，采用平板菌落计数法统计肠道内容物大肠杆菌、沙门氏菌和乳酸菌活菌数[11]。其中，大肠杆菌采用EMB琼脂平板，沙门氏菌采用HE琼脂平板，37 ℃有氧培养24 h后进行菌落计数；乳酸菌采用LBS琼脂平板，37 ℃厌氧培养48 h后进行菌落计数。菌群数量以每克肠道内容物所含细菌群落总数的对数lg CFU/g表示。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1连翘叶微生态制剂对肉鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，与空白对照组相比，1~21日龄时，基础日粮中添加抗生素或连翘叶微生态制剂对肉鸡末重、平均日增重、平均日采食量及料重比均无显著影响（P0.05）。22~42日龄时，与空白对照组相比，抗生素组、连翘叶微生态制剂Ⅲ组末重显著增加9.21%、9.09%（P0.05）；抗生素组、连翘叶微生态制剂Ⅱ组和Ⅲ组平均日增重显著增加12.37%、9.68%和11.62%（P0.05），料重比显著降低11.40%、12.95%和13.99%（P0.05）。1~42日龄时，抗生素组、连翘叶微生态制剂Ⅱ组和Ⅲ组平均日增重显著增加9.33%、8.08%和9.31%（P0.05），料重比显著降低7.91%、9.04%和9.61%（P0.05）。结果表明，在日粮中添加连翘叶微生态制剂可增加肉鸡的平均日增重，降低料重比，提高肉鸡的生长性能。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.010.T002表2连翘叶微生态制剂对肉鸡生长性能的影响项目空白对照组抗生素组连翘叶微生态制剂Ⅰ组连翘叶微生态制剂Ⅱ组连翘叶微生态制剂Ⅲ组1~21日龄初重/g45.61±1.9447.29±2.4346.09±2.8746.52±2.1744.83±2.0621日龄重/g826.64±20.74857.39±27.79842.42±16.29867.59±25.79865.24±19.98平均日增重/[g/(只·d)]37.19±2.0838.58±2.6737.92±2.8539.10±2.6139.07±3.10平均日采食量/[g/(只·d)]54.67±3.2657.87±4.7958.02±4.3157.09±3.4658.21±4.07料重比1.47±0.071.50±0.061.53±0.111.46±0.081.49±0.0822~42日龄42日龄重/g2 264.90±46.84b2 473.45±30.92a2 327.22±32.09b2 445.18±49.78b2 470.79±34.08a平均日增重/[g/(只·d)]68.49±3.51b76.96±4.18a70.71±3.57b75.12±3.74a76.45±4.06a平均日采食量/[g/(只·d)]132.19±6.69131.60±6.03130.81±7.62126.20±5.45126.91±7.39料重比1.93±0.10a1.71±0.12b1.85±0.14a1.68±0.06b1.66±0.11b1~42日龄平均日增重/[g/(只·d)]52.84±2.96a57.77±2.67b54.31±3.45a57.11±3.28b57.76±3.26b平均日采食量/[g/(只·d)]93.43±6.7694.73±5.5394.42±5.1291.65±6.0292.56±5.40料重比1.77±0.06a1.63±0.09b1.74±0.12a1.61±0.10b1.60±0.08b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2连翘叶微生态制剂对肉鸡血清肝功能指标的影响（见表3）由表3可知，与空白对照组相比，连翘叶微生态制剂Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组血清中肝功能指标AST、ALT活性均无显著变化（P0.05），连翘叶微生态制剂对肉鸡肝功能无明显影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.010.T003表3连翘叶微生态制剂对肉鸡血清肝功能指标的影响组别ASTALT空白对照组105.69±6.7922.82±1.36抗生素组109.28±9.3021.90±1.04连翘叶微生态制剂Ⅰ组106.21±7.2521.06±1.53连翘叶微生态制剂Ⅱ组112.87±5.0622.35±0.93连翘叶微生态制剂Ⅲ组107.96±6.1123.67±1.82U/L2.3连翘叶微生态制剂对肉鸡血清抗氧化能力的影响（见表4）由表4可知，与空白对照组相比，连翘叶微生态制剂Ⅲ组血清中SOD和GSH-Px活性显著提高29.94%、18.80%（P0.05）；连翘叶微生态制剂Ⅱ组、Ⅲ组血清中MDA含量显著降低20.35%、25.80%（P0.05）。结果表明在日粮中添加连翘叶微生态制剂可增强血清中抗氧化酶活性，提高肉鸡抗氧化能力，降低氧化损伤。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.010.T004表4连翘叶微生态制剂对肉鸡血清抗氧化能力的影响组别SOD/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)MDA/(μmol/L)空白对照组189.24±9.57b428.71±12.67b6.24±0.18a抗生素组195.36±10.23b436.86±15.36b6.36±0.29a连翘叶微生态制剂Ⅰ组193.78±8.79b449.74±21.03b6.10±0.15a连翘叶微生态制剂Ⅱ组206.69±13.64b456.97±10.89b4.97±0.12b连翘叶微生态制剂Ⅲ组245.89±15.67a509.31±13.62a4.63±0.17b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.4连翘叶微生态制剂对肉鸡免疫器官指数的影响（见表5）由表5可知，与空白对照组相比，连翘叶微生态制剂Ⅱ组、Ⅲ组胸腺指数、脾脏指数显著升高，分别升高14.40%、15.97%和17.24%、20.69%（P0.05）；抗生素组和连翘叶微生态制剂Ⅲ组法氏囊指数显著升高，分别升高16.13%、23.96%（P0.05）。结果表明连翘叶微生态制剂可提高肉鸡免疫器官指数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.010.T005表5连翘叶微生态制剂对肉鸡免疫器官指数的影响组别胸腺指数法氏囊指数脾脏指数空白对照组3.82±0.21b2.17±0.15b0.87±0.07b抗生素组3.86±0.25b2.52±0.28a0.92±0.06b连翘叶微生态制剂Ⅰ组3.96±0.19b2.06±0.18b0.85±0.10b连翘叶微生态制剂Ⅱ组4.37±0.21a2.26±0.15b1.02±0.15a连翘叶微生态制剂Ⅲ组4.43±0.27a2.69±0.25a1.05±0.08ag/kg2.5连翘叶微生态制剂对肉鸡血清免疫指标的影响（见表6）由表6可知，与空白对照组相比，连翘叶微生态制剂Ⅱ组、Ⅲ组血清中IgA含量显著提高13.57%、18.43%（P0.05）；抗生素组、连翘叶微生态制剂Ⅲ组血清中IgG含量显著提高24.11%、13.03%（P0.05）；抗生素组血清中IgM含量显著提高17.46%（P0.05）；连翘叶微生态制剂Ⅲ组血清中促炎性因子TNF-α、IL-6含量显著降低15.78%、21.95%（P0.05）；抗生素组IL-6含量显著降低18.53%（P0.05）；抗生素组、连翘叶微生态制剂Ⅲ组血清中抗炎性因子IL-10含量显著升高12.65%、17.67%（P0.05）。结果表明连翘叶微生态制剂可以提高肉鸡血清中免疫球蛋白含量，调节炎性因子的表达。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.010.T006表6连翘叶微生态制剂对肉鸡血清免疫指标的影响组别IgA/(mg/L)IgG/(mg/L)IgM/(mg/L)TNF-α/(ng/L)IL-6/(ng/L)IL-10/(ng/L)空白对照组322.86±15.17b2 492.93±155.67b690.32±38.65b46.51±2.82a64.29±3.91a78.17±4.33b抗生素组319.79±25.36b3 094.07±221.64a810.86±55.71a47.24±2.13a52.38±2.36b88.06±3.51a连翘叶微生态制剂Ⅰ组341.82±20.75b2 571.65±105.32b656.34±44.25b44.62±1.97a63.06±3.19a80.27±3.96b连翘叶微生态制剂Ⅱ组366.67±16.81a2 605.72±253.83b679.89±52.27b44.79±2.91a58.17±2.24a82.81±5.12b连翘叶微生态制剂Ⅲ组382.37±26.29a2 817.86±215.94a707.86±47.62b39.17±1.67b50.18±1.67b91.98±3.16a2.6连翘叶微生态制剂对肉鸡肠道菌群的影响（见表7）由表7可知，与空白对照组相比，抗生素组肠道中和乳酸菌数量显著降低20.83%、26.15%和11.17%（P0.05）；连翘叶微生态制剂Ⅱ组、Ⅲ组肠道中大肠杆菌数显著降低13.09%、16.90%（P0.05），乳酸菌数显著升高15.71%、19.55%（P0.05）；连翘叶微生态制剂Ⅲ组肠道中沙门氏菌数显著降低11.47%（P0.05）。结果表明连翘叶微生态制剂可以抑制肠道中致病性大肠杆菌、沙门氏菌生长，促进益生性乳酸菌增殖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.010.T007表7连翘叶微生态制剂对肉鸡肠道菌群的影响组别大肠杆菌数沙门氏菌数乳酸菌空白对照组9.17±0.45a4.36±0.26a5.73±0.28a抗生素组7.26±0.38b3.22±0.24b5.09±0.25b连翘叶微生态制剂Ⅰ组8.53±0.47a4.63±0.35a6.05±0.37a连翘叶微生态制剂Ⅱ组7.97±0.42b4.29±0.37a6.63±0.22b连翘叶微生态制剂Ⅲ组7.62±0.35b3.86±0.19b6.85±0.31blg CFU/g3讨论3.1连翘叶微生态制剂对肉鸡生长性能的影响抗生素在促进畜禽生产的规模化、集约化方面发挥巨大作用。畜禽饲料中添加少量的、非治疗剂量的抗生素可有效预防或阻断疾病的发生与传播，促进饲料转化和动物生长发育，缩短畜禽生长周期，提高畜禽养殖经济效益[13-14]。如饲喂金霉素可提高肉鸡血清中总抗体水平，增强肉鸡免疫功能，有效改善肉鸡生长性能[15]。基础日粮中添加敌它霉素和吉他霉素可明显提高藏香猪育肥期的饲料转化率，降低藏香猪的发病率和死亡率[16]。本试验中，饲喂添加林可霉素的试验日粮可提高肉鸡的平均日增重，降低料重比。然而，抗生素在长期使用过程容易促使耐药菌的产生，引起畜禽产品中抗生素残留，并导致水土环境中抗生素累积，对生态平衡及人类健康造成了潜在风险[17]。因此，寻找抗生素替代品，减少抗生素的使用尤为重要。中药微生态制剂能够在防控疫病，调控畜禽生长，改善产品品质等方面替代抗生素，已广泛应用于畜禽养殖业[18]。由山楂、神曲、麦芽、黄芪、党参、苍术等组成，并经酵母、乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌发酵而成的中药微生态制剂对黑山羊具有明显的保健作用，能够调节肝脏脂质代谢，预防疾病发生，提高生长性能[19]。白羽肉鸡饲喂由茵陈、五味子、白芍、板蓝根、珍珠草、垂盆草等组成的中药复方微生态制剂可以调整肠道菌群，维护肠道健康，抑制药物引起的肝损伤，降低死亡率，提高养殖经济效益[20]。本试验所用的连翘叶微生态制剂是一种将连翘叶经枯草芽孢杆菌、乳酸菌等益生菌发酵、转化等加工工艺制成的生物制剂。试验结果显示，饲喂连翘叶微生态制剂可明显提高肉鸡平均日增重，促进饲料转化，降低料重比，在改善肉鸡生长性能方面具有与抗生素相近的效果。肝脏是机体物质代谢中心，AST、ALT是主要存在于肝脏中的蛋白质代谢酶。肝脏发生损伤时，AST、ALT被释放到血液中。因此，血清AST、ALT活性是反映肝细胞损伤的重要指标[19]。本试验中，连翘叶微生态制剂对血清AST、ALT活性无明显影响，表明连翘叶微生态制剂无明显肝毒性，具有良好的安全性。综上所述，将连翘叶微生态制剂应用于畜禽养殖既能够满足当前畜禽生产中对抗生素替代物的市场需求，还可提高连翘叶资源的综合利用度，具有较大的开发应用潜力。3.2连翘叶微生态制剂对肉鸡血清抗氧化能力的影响肉鸡在养殖过程中受到如环境变化、过度疲劳、疾病等异常刺激时会导致体内自由基代谢失衡，诱发氧化应激发生，损害脂质、蛋白质、核酸和染色体的正常功能，进而严重影响细胞结构的稳定性，降低动物生长性能[21]。补充抗氧化剂则可有效抑制氧化损伤，预防疾病发生，提高肉鸡生产效率[22]。连翘叶中含有连翘酯苷、酚类等天然抗氧化成分，能够明显清除DPPH、OH和ABTS+自由基，抑制氧化应激引起的线粒体损伤，具有较强的抗氧化能力[7]。SOD和GSH-Px是体内关键抗氧化酶，其活性反映了机体清除自由基的能力。MDA是脂质过氧化的最终产物，其含量与细胞损伤程度正相关。本试验结果显示，连翘叶微生态制剂可提高血清SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量。表明连翘叶微生态制剂可能通过增强血清中抗氧化酶活性，清除体内过量的自由基或增强对氧化损伤的修复能力，抑制氧化应激，促进肉鸡生长。3.3连翘叶微生态制剂对肉鸡免疫功能的影响连翘叶微生态制剂促进肉鸡生长的能力可能与其调节免疫功能有关。胸腺、脾脏及法氏囊等免疫器官指数反映了禽类免疫器官发育状况好坏，通常用于评价免疫机能的增强或抑制。免疫球蛋白IgA、IgG、IgM直接参与机体的体液免疫，具有抗细菌、病毒感染等多种生物活性，其含量与机体的抗病力有关[23]。炎性因子是免疫应答中的关键组分，促炎性因子TNF-α和IL-6可诱生其他炎症细胞因子或趋化因子，使炎症持续放大；抗炎性因子IL-10则能够抑制炎性介质的产生，减轻炎性细胞浸润[22]。本试验中，饲喂连翘叶微生态制剂后，肉鸡胸腺、脾脏及法氏囊指数及血清中IgA、IgG含量较空白对照组均显著提高。同时，连翘叶微生态制剂不仅能够抑制血清中TNF-α、IL-6的分泌，还可提高IL-10的表达量。因此，连翘叶微生态制剂可能通过增强肉鸡的免疫力，影响炎性因子的分泌，提高对各种病原体或疾病的抵抗力。3.4连翘叶微生态制剂对肉鸡肠道微生物的影响与空白对照组相比，连翘叶微生态制剂可明显抑制肠道中致病性大肠杆菌、沙门氏菌生长，促进益生性乳酸菌繁殖，而抗生素则无选择性地减少致病菌和益生菌的数量。因此，连翘叶微生态制剂可以通补充肉鸡肠道内的有益微生物，利于乳酸菌大量增殖，竞争性地抑制致病菌的定植与生长，有效地克服了抗生素能够引起菌群失调的缺点，优化了肠道微生态环境[24-25]。此外，微生物代谢过程中产生大量酶类、有机酸、蛋白质以及氨基酸等生物活性物质，能够促使连翘叶有效成分释放与转化，增强动物体营养吸收，提高饲料的转化率[26-27]。但目前对于连翘叶微生态制剂调节肠道菌群的具体机制及其与增强机体免疫力、促进动物生长之间的联系仍需进一步探究。4结论本试验结果表明，日粮中添加2 000和4 000 mg/kg连翘叶微生态制剂均能够显著促进肉鸡生长，提高饲料利用率，增强机体抗氧化能力和免疫功能，改善肠道菌群结构。