真菌是一种生命力极强的腐败性微生物，饲料被霉菌污染导致巨大损失[1]。霉菌可以在一些食品以及动物饲料中生长且会产生对人体和动物不利的物质，如黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT）、串珠镰刀菌素（moniliformin）、赫曲霉毒素（ochratoxin，OCT）、单端孢霉烯族毒素（trichothecenes）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）[2]。这些毒素具有致癌致畸性，对机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等有毒害作用。如20世纪60年代英国的“火鸡X病”被证实是由黄曲霉毒素B1（AFB1）所导致的，产生AFB1的微生物是黄曲霉菌（Aspergillus flavus）[3]。抑制霉菌的方法包括干燥、热处理、红外线处理等物理方法，或者添加化学防腐剂如乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、苯甲酸（benzoic acid）等。但是，传统方法在一定程度上会对人和动物的健康及环境带来危害。乳酸菌是一种传统的发酵菌株，通过分泌具有抗真菌活性的各种化合物而表现出拮抗特性[4-5]。此外，乳酸菌还可以通过细胞壁中所含有的成分与霉菌毒素相结合，达到降解霉菌毒素的目的[6]。从发霉的青贮中分离筛选黄曲霉菌，然后再从发酵良好的青贮饲料、酸奶以及奶豆腐中定向优选出能够抑制黄曲霉菌的乳酸菌，并且分析研究乳酸菌的抑霉菌活性及可能产生的抑菌物质，对提高青贮饲料的质量安全、抑制霉菌繁殖具有重要意义。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品来源从山西省朔州地区采集发酵良好的青贮饲料样品和发霉变质的青贮饲料样品。从内蒙古包头市的市场购买酸奶、奶豆腐。样品封存于密封袋中，带回实验室，存放于4 ℃冰箱中保存备用，用于乳酸菌和霉菌的提取。1.1.2主要培养基MRS固体琼脂培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉5 g/L、吐温80 1 mL/L、磷酸氢二钾2 g/L、酵母浸粉4 g/L、硫酸镁0.2 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸锰0.05 g/L、乙酸钠5 g/L、琼脂粉22 g/L，定溶于1 L蒸馏水中，在121℃下灭菌15 min。MRS肉汤培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉5 g/L、吐温80 1 mL/L、磷酸氢二钾2 g/L、酵母浸粉4 g/L、硫酸镁0.2 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸锰0.05 g/L、乙酸钠5 g/L，定溶于1 L蒸馏水中，在121 ℃下灭菌15 min。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：将马铃薯洗净后去皮，称取200 g马铃薯并切成小块，加水煮至能被玻璃棒戳破即可。四层纱布过滤，加入20 g葡萄糖，冷却后补充体积至1 000 mL，固体培养基加3%琼脂粉，半固体培养基加1.5%琼脂粉，在115 ℃下灭菌30 min，取出摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。1.2试验方法1.2.1霉菌的初筛在PDA平板培养基中采用稀释涂布平板法从采集的样品中，分离出霉菌，从长势较好的培养基中挑取出单独的菌落划线培养，在PDA平板上纯化，放置于28 ℃下避光倒置培养5~7 d。从培养基中选取长势好的菌株接种到PDA的斜面培养基上，并在培养基中倒入液体石蜡，存放于4 ℃的冰箱中进行保存备用。1.2.2霉菌的复筛将初筛的菌种从加入液体石蜡的试管中取出并活化，将活化的霉菌接种到PDA培养基上，28 ℃下避光倒置培养5~7 d，从培养基中挑选背面呈淡黄色，霉菌表面的孢子呈黄色的菌株接种到PDA的斜面培养基上，在培养基中倒入液体石蜡，存放于4 ℃的冰箱中进行保存备用。1.2.3抑霉乳酸菌的初筛菌株的分离鉴定可以参考《常见细菌系统鉴定手册》和《乳酸细菌：基础、技术和应用》[7-8]中所描述的乳酸菌菌株形态。在固体MRS琼脂培养基中采用稀释涂布平板法从采集的样品中，分离出乳酸菌，挑取单菌落划线培养（根据平板上所生长菌落的颜色、大小、光泽、是否出现透明圈等），在MRS固体琼脂平板培养基中纯化，于35 ℃下倒置培养24~48 h。将纯化过的单菌落在MRS固体琼脂斜面培养基上接种，于35 ℃下进行斜面培养24~48 h，培养基中注入无菌液体石蜡进行保藏并编号，注入量以刚超过培养基为宜，把加入液体石蜡的试管竖直向上存放于4 ℃的冰箱中进行保存备用。1.2.4抑霉乳酸菌的复筛采用双层平板法[9]从初筛的菌株中挑选出具有抑制霉菌活性的乳酸菌菌株。用固体MRS琼脂培养基制成下层平板，用活化好的乳酸菌在下层平板上划两条约2 cm长的细线，置于35 ℃的恒温培养箱中培养24 h。待乳酸菌全部长出之后，制备PDA半固体培养基，将含有106 孢子/mL的霉菌孢子液倒入此培养基中，然后在下层平板上倒入含有106 孢子/mL的PDA半固体培养基制作成上层平板，待凝固之后，将平板置于28~30 ℃的恒温培养箱中静置培养4~7 d。待霉菌长出孢子之后，观察乳酸菌生长的条带周围是否会出现抑菌圈。1.2.5抑霉乳酸菌和霉菌的分子鉴定及系统发育树构建选出霉菌以及具有降解能力的乳酸菌菌株进行编号，在PDA培养基和MRS固体琼脂培养基进行斜面培养后，邮送到南昌科畅生物技术有限公司进行目的菌株DNA序列分析及鉴定，用Omega细菌、真菌基因组DNA抽提试剂盒，提取菌株的总DNA，之后用27F和1492R引物PCR扩增细菌的16S rDNA，ITS1和ITS4引物PCR扩增真菌的特异性片段。将测序菌株的16S rDNA序列上传到NCBI数据库进行比对，运用BLAST程序包进行序列相似性比较，确定其最可能的种名。将鉴定后菌株的16S rDNA序列和模式菌株序列导入MEGA7.0软件进行菌株的系统发育分析（phylogenetic analysis），再运用邻接法（neighbor-joining method）制作菌株的系统发育树。1.2.6霉菌孢子液的制备将吐温80（浓度为0.05%）溶液倒入接种霉菌的试管中，振荡5 min，刮取生长于菌丝体上的霉菌孢子，将含有霉菌孢子的混合液通过无菌纱布过滤，以去除营养菌丝体[10]。然后使用血球计数板制成106 孢子/mL的霉菌孢子液，放于4 ℃的冰箱中保存备用。1.2.7抑霉乳酸菌光镜鉴别将筛选的乳酸菌接种在固体MRS琼脂培养基上，在35 ℃下培养24~48 h，挑取单菌落进行革兰氏染色，用100倍油镜观察细胞形状、大小。1.2.8乳酸菌无细胞上清液（CFS）抑制霉菌活性测定将乳酸菌在MRS肉汤中于35 ℃下培养24~48 h。然后将培养物离心（13 000 r/min，10 min），并将得到的CFS通过0.2 μm孔径的无菌注射过滤器过滤。将CFS以10%、20%、30%的浓度比例分别加入PDA培养基中。通过将浓度为106 孢子/mL的霉菌孢子液滴在平板中心。在对照试验中，CFS被MRS肉汤所代替。将平板放置在恒温培养箱中，在黑暗条件下于28 ℃培养7 d。然后测量抑菌圈的直径，检测CFS的抑霉菌活性。1.2.9乳酸菌抑制霉菌有效成分分析通过蛋白酶处理和高温处理，分析乳酸菌的CFS对霉菌起抑制作用的有效成分[11]。分别向乳酸菌的CFS中加入胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsin）、蛋白酶K（proteinase K），且蛋白酶的终质量浓度为1 mg/mL，在温度为37 ℃的水浴锅中放置2 h后取出，在80 ℃下进行水浴处理2 min，以使酶失去活性。测试在经过不同的蛋白酶处理后，CFS是否具有抑制霉菌的活性，对照组是未使用蛋白酶处理的CFS。将乳酸菌的CFS放置于水浴锅中处理5 min，水浴处理温度分别为60、80、100 ℃，测试在经过不同温度处理后，CFS对霉菌是否具有抑制作用，以用来检测所产生抑菌物质的热稳定性，用未处理过的CFS作为对照。2结果与分析2.1霉菌的筛选2.1.1霉菌的初筛（见图1）本研究使用PDA培养基对发霉变质的青贮饲料样品中的霉菌进行分离纯化。将采集的样品初次分离后，在PDA培养基上长出较多菌落，随后挑选出菌落形态差异较大的单菌落在PDA培养基上再次进行划线纯化，得到3株霉菌菌株，将这3株霉菌分别命名为M1、M2、M3。观察3株霉菌的菌落形态特征，初步确定其分类单位[12]。由图1可知，M1的单菌落会向周围扩散生长，出现多菌落时菌落之间会出现空隙，此菌落向外生长时会呈现放射状凹槽，菌落不会出现粘连生长的现象，在培养基中观察菌落的背面呈现淡黄色，表面的孢子呈现黄色。菌丝之间出现隔、且大量的分生孢子梗产生于菌丝体。分生孢子梗的顶端出现膨大现象，会成为顶囊，以球形出现，在顶囊的表面会有多层辐射状小梗出现，且在小梗顶端生长着成串的分生孢子。与M1菌落相比较而言，M2和M3菌落的萌发较缓慢，扩展有局限性，菌落的质地紧密，且在菌落表面会有呈深绿色的粉末状结构出现，从培养基的背面观察菌落为黑色。且菌丝之间有横隔出现，无足细胞出现，分生孢子梗有分支，顶端不会膨大，且没有顶囊，孢子呈穗形如扫帚一般。在分生孢子的小梗顶端会产生成串的分生孢子，且孢子都为单细胞、呈卵圆形出现。根据所描述的霉菌菌落形态特征，初步确定M1为曲霉菌，M2和M3为青霉菌。图1霉菌的菌落形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F001（a）菌株M110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F002（b）菌株M210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F003（c）菌株M32.1.2霉菌的复筛将初筛后的霉菌进行复筛，把M1菌株接种到PDA培养基上，在28 ℃下避光倒置培养5~7 d，从培养基中挑选背面呈淡黄色，霉菌表面的孢子呈黄色且长势较好的菌株接种到PDA斜面培养基上进行培养，为后面一系列试验做准备。2.2抑霉乳酸菌的筛选2.2.1抑霉乳酸菌的初筛（见图2）通过采用MRS琼脂培养基对发酵良好的青贮饲料样品、酸奶以及奶豆腐中的乳酸菌进行分离纯化。由图2可知，将采集的这些样品进行初次分离后，经过24~48 h培养，在MRS培养基上长出较多的菌落，随后从不同的培养皿中挑选出表面形态呈白色、圆形、边缘整齐、中央突起、质地黏稠、有光泽且不透明、表面呈现细密且光滑状态的菌落进行纯化培养，得到4株乳酸菌菌株，将这4株乳酸菌分别命名为L1、L2、L3、L4，且菌株L1、L2来自青贮饲料，L3和L4分别来自酸奶和奶豆腐。图2乳酸菌的菌株形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F004（a）L110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F005（b）L210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F006（c）L310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F007（d）L42.2.2抑霉乳酸菌的复筛（见图3）以发霉变质的饲料样品中分离的霉菌M1作为测试菌，通过采用双层平板法对初筛结果中分离纯化的乳酸菌进行复筛，测试其对霉菌的抑制效果。由图3可知，在接种的2条乳酸菌条带周围出现明显的抑菌圈。结果表明，乳酸菌L1对霉菌M1具有明显的抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F008图3具有抑制霉菌活性的乳酸菌2.3乳酸菌和霉菌的分子鉴定以及系统发育树的构建（见图4、图5）使用MEGA7.0软件对霉菌以及具有霉菌抑制活性的乳酸菌分别进行分子鉴定以及系统发育树的构建，目的是确定两株菌株的分类地位。系统发育树的置信度均高于90。将所测序列上传到NCBI数据库进行对比，然后运用BLAST程序包进行菌株序列的相似性比较，确定其最可能的种名。由图4可知，菌株L1的16S rDNA基因序列与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的同源性超过99%。由图5可知，菌株M1的序列与黄曲霉菌序列的相似度达到99%，由此确定菌株L1为植物乳杆菌（L. plantarum），菌株M1为黄曲霉菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F009图4植物乳杆菌系统发育树10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F010图5黄曲霉菌系统发育树2.4抑霉乳酸菌光镜鉴别（见图6）将乳酸菌进行革兰氏染色，在光学显微镜下用低倍镜进行观察，发现目的菌株后，转用油镜观察形态。由图6可知，在显微镜下此菌落的形状呈现为小杆状，并且革兰氏染色后呈现为紫色，证明为革兰氏阳性菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.F011图6乳酸菌形态学鉴定结果（1 000×）2.5乳酸菌无细胞上清液（CFS）对霉菌的抑制测定（见表1）通过制备乳酸菌的CFS进一步测定乳酸菌对发霉变质的青贮饲料样品中分离纯化霉菌的抑制效果。由表1可知，从发酵良好的青贮饲料样品中分离筛选得到的植物乳杆菌对发霉变质的青贮饲料样品中分离筛选得到的黄曲霉菌有较为明显的抑菌效果。随着CFS浓度的增加，植物乳杆菌对黄曲霉菌的抑制作用也在逐渐增强。CFS的浓度最大时，植物乳杆菌对黄曲霉菌的抑制效果达到最好，抑菌圈的直径可以达到25 mm。当CFS的浓度仅为10%时，抑菌圈的直径就已经为14 mm。这表明植物乳杆菌的抑菌作用较强。不加入CFS的对照组中，霉菌依然繁殖较快。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.T001表17 d后不同浓度的乳酸菌CFS对黄曲霉菌的抑制效果CFS抑菌圈直径0010%1420%1830%25mm2.6CFS抑制霉菌有效成分的分析（见表2、表3）由表2可知，植物乳杆菌的CFS经过蛋白酶K处理，抑菌活性出现降低的现象，而经过胃蛋白酶以及胰蛋白酶处理后，CFS对黄曲霉菌的抑菌活性没有出现改变的现象。这是因为蛋白酶K属于切割性比较广的高活性蛋白酶，与胃蛋白酶和胰蛋白酶相比较，其作用的肽键范围更加广泛[13]。由此可以推测，上述植物乳杆菌的CFS中存在着像蛋白质或者肽类的抑霉菌活性物质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.T002表2不同蛋白酶处理对乳酸菌CFS抑制霉菌活性的影响蛋白酶处理抑制活性CFS+++胃蛋白酶+++胰蛋白酶+++蛋白酶K+注：－没有出现抑菌圈，＋抑菌圈的直径为6~12 mm，＋＋抑菌圈的直径为12~18 mm，＋＋＋抑菌圈的直径大于18 mm；下表同。由表3可知，CFS在水浴锅中经过60、80、100 ℃的水浴处理5 min后，植物乳杆菌对黄曲霉菌的抑菌活性几乎没有受到影响（抑菌圈的直径大于18 mm）。因此，植物乳杆菌CFS中的抑菌活性物质的热稳定性较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.015.T003表3热处理对乳酸菌CFS抑制霉菌活性的影响热处理抑制活性CFS+++60/℃+++80/℃+++100/℃+++3讨论乳酸菌是在发酵生产中必不可少的微生物菌种。乳酸菌具有黏附性和定植能力，可以产生特殊酶系，产生抑菌活性代谢物质等生理功能[14]。其可以通过分泌具有抗真菌活性的各种化合物，如有机酸、脂肪酸、环二肽等物质，从而起到抑制真菌生长的作用[5,15]。研究表明，乳球菌属（Lactococcus schleifer）、乳杆菌属（Lactobacillus beijerinck）、片球菌属（Pediococcus claussen）和明串珠菌属（Leuconostoc）的物种，因其能够抑制产毒真菌的能力而被认可[2,16]。Ilavenil等[17]研究表明，乳酸菌菌株对烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus），产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum），娄地青霉菌（Penicillium roqueforti），椭圆葡萄球菌（Botrytis elliptica）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有广泛的抗真菌特性。乳酸菌产生的抗真菌化合物在很大的pH值范围内都具有活性，具有热稳定性，但是用蛋白水解酶处理之后抑制活性会消失[18]。因乳酸菌的酶促活性产生的抗真菌肽是化学防腐剂的天然替代品，某些乳酸菌菌株可在多种动物、植物和副产物底物中产生这类抗真菌肽[19]。有研究表明，乳酸菌的CFS对真菌分生孢子的萌发具有一定的抑制作用，阻止真菌菌丝的形成，抑制黄曲霉菌的生长[20-22]。乳酸菌是公认的安全性微生物，以其对腐败真菌的抗真菌活性而闻名[23]，因此选用乳酸菌作为添加剂代替化学抑霉试剂是一种安全有效的方法。4结论从发霉变质的青贮饲料样品中分离筛选鉴定黄曲霉菌，从良好的青贮饲料样品中分离筛选鉴定植物乳杆菌。采用双层平板法评价植物乳杆菌抑制黄曲霉菌活性的作用，制备乳酸菌CFS进一步分析乳酸菌对霉菌的抑制效应。经蛋白酶处理法以及高温处理法分析植物乳杆菌抑制黄曲霉菌的可能有效成分，植物乳杆菌的CFS中可能存在蛋白质、肽类等的抑菌活性物质。这些抑菌活性物质热稳定性较高。选用植物乳杆菌作为青贮饲料的生物防腐剂可以减少霉菌对其的污染，以提高其安全性。