银杏叶含有多种营养成分，包括蛋白质、氨基酸、黄酮、萜内酯、多糖、有机酸、多种微量元素等，而其中黄酮类、萜内酯化合物是其重要的活性成分[1-2]。在畜禽生产中应用银杏叶能促进机体生长发育、改善抗氧化功能、提高免疫功能、促进瘤胃发酵、治疗腹泻，是一种新型的绿色饲料添加剂[3-6]。当前，采用甲醇、乙醇、水等溶剂提取银杏叶的有效成分是银杏叶的主要利用方式，但传统溶剂浸提法容易造成有效成分的大量流失，也破坏了银杏叶的绿色天然[7]。而利用微生物发酵银杏叶生产蛋白饲料，能使银杏叶中有效成分的作用得到充分发挥。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种常见的革兰氏阳性嗜热细菌，将其作为固态发酵生产蛋白饲料的菌种，能够提高蛋白饲料的饲用品质[8-9]。因此，本试验选择地衣芽孢杆菌作为发酵菌种生产银杏叶蛋白饲料，优化银杏叶固态发酵条件，并评定银杏叶固态发酵蛋白饲料的营养价值，为银杏叶在饲料生产中的有效利用提供参考。1材料与方法1.1发酵基质银杏叶为市售，60 ℃烘干，粉碎后过40目筛，保存待用。1.2发酵菌种地衣芽孢杆菌由广东省微生物保藏中心保藏（保藏号：1.626）。1.3培养基种子培养基：选择马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），取马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 L，37 ℃培养24 h。发酵培养基：银杏叶粉20 g、葡萄糖1.5%、K2HPO4 0.3%、MgSO4∙7H2O 0.05%，放入250 mL三角瓶中，搅拌均匀，121 ℃灭菌30 min。1.4银杏叶固态发酵条件的优化1.4.1单因素试验采用单因素试验，以发酵产物中的粗蛋白含量为主要考查指标，对接种量（1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%）、含水量（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%）、发酵温度（22、25、28、31、34、37、40 ℃）、发酵时间（12、24、36、48、60、72、84 h）对发酵效果的影响进行研究。1.4.2正交试验在单因素试验的基础上，设计L9（34）正交试验，确定银杏叶固态发酵的最佳工艺参数。正交试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.017.T001表1正交试验设计水平接种量/%含水量/%发酵温度/℃发酵时间/h16403160285034723106037841.5银杏叶固态发酵效果的评价在选定的最优工艺条件下发酵银杏叶，对比银杏叶固态发酵前后的粗蛋白、粗纤维、粗灰分、粗脂肪、总黄酮、总氨基酸含量，评价银杏叶固态发酵效果。粗蛋白（CP）含量测定参照GB 5009.5—2010，凯氏定氮法；粗纤维（CF）含量测定参照GB/T 6434—2006，过滤法；粗灰分（ASH）含量测定参照GB/T 6438—1992，灰化法；粗脂肪（EE）GB/T 6433—2006，索氏提取法；总黄酮（total flavonoids）含量测定参照GB/T 20574—2006，分光光度比色法；总氨基酸含量采用S433D型全自动氨基酸分析仪测定。1.6数据统计与分析试验数据采用Excel表格进行整理，采用SPSS 20.0统计分析软件进行正交试验的多重比较和方差分析。2结果与分析2.1单因素试验2.1.1接种量对银杏叶固态发酵的影响按不同接种量分别将地衣芽孢杆菌接入发酵培养基，在含水量为50%、发酵温度为31 ℃、发酵时间为24 h的条件下生产银杏叶蛋白饲料，发酵培养物中粗蛋白含量见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.017.F001图1接种量对银杏叶固态发酵饲料粗蛋白含量的影响由图1可知，在地衣芽孢杆菌的接种量处于较低水平时，银杏叶固态发酵饲料的粗蛋白含量较低。随着接种量的增加，银杏叶固态发酵饲料的发酵更充分，粗蛋白含量呈升高趋势，在接种量为8%时达到最高，为23.7%。但随着接种量的进一步增加，大量的微生物快速繁殖，银杏叶的营养成分被过度消耗，反而造成发酵培养物的粗蛋白含量下降。由此确定正交试验的接种量为6%、8%、10%。2.1.2含水量对银杏叶固态发酵的影响按不同含水量分别对银杏叶进行固态发酵，在接种量为8%、发酵温度为30 ℃、发酵时间为24 h的条件下生产银杏叶蛋白饲料，发酵培养物中粗蛋白含量见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.017.F002图2含水量对银杏叶固态发酵饲料粗蛋白含量的影响在固态发酵银杏叶生产蛋白饲料的过程中，适宜的含水量能使培养基具有很好的膨胀度，为地衣芽孢杆菌的生长和繁殖提供有效的媒介。在发酵过程中，过少的含水量会抑制微生物的生长繁殖，而过多的含水量会造成发酵培养物的黏性增加，透气性降低，也会抑制微生物的生长繁殖。由图2可知，在含水量为50%的条件下发酵培养物的粗蛋白含量达到最高，为23.25%。因此确定正交试验的含水量为40%、50%、60%。2.1.3发酵温度对银杏叶固态发酵的影响按不同发酵温度分别对银杏叶进行固态发酵，在接种量为8%、含水量为50%、发酵时间为24 h的条件下生产银杏叶蛋白饲料，发酵培养物中粗蛋白含量见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.017.F003图3发酵温度对银杏叶固态发酵饲料粗蛋白含量的影响由图3可知，随着发酵温度的升高，银杏叶固态发酵培养物的粗蛋白含量逐渐升高，在34 ℃时发酵培养物的粗蛋白含量达到最高，为22.89%。当温度超过34 ℃时，银杏叶固态发酵培养物的粗蛋白含量逐渐降低，因此确定正交试验的发酵温度为31、34、37 ℃。2.1.4发酵时间对银杏叶固态发酵的影响按不同发酵时间分别对银杏叶进行固态发酵，在接种量为8%、含水量为50%、发酵温度为34 ℃的条件下生产银杏叶蛋白饲料，发酵培养物中粗蛋白含量见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.017.F004图4发酵时间对银杏叶固态发酵饲料粗蛋白含量的影响由图4可知，在发酵12~60 h，发酵培养物的粗蛋白含量迅速升高；发酵60 h后，发酵速度逐步趋于平缓，发酵培养物的粗蛋白含量趋于稳定，在72 h达到最高，因此确定正交试验的发酵时间为60、72、84 h。2.2正交试验正交试验极差分析结果见表2，方差分析结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.017.T002表2正交试验极差分析编号接种量/%含水量/%发酵温度/℃发酵时间/h粗蛋白含量/%1640316021.702650347222.913660378422.654840377223.185850318424.336860346023.8071040348423.6181050376023.5091060317222.99K167.2668.4969.0269.00K271.3170.7470.3269.08K370.1069.4469.3270.59R4.311.270.800.0710.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.017.T003表3正交试验方差分析结变异来源平方和自由度均方F值P值接种量8.61024.30560.9380.000含水量2.54721.27318.0270.000发酵温度0.92520.4636.5480.001发酵时间1.60220.80111.3360.007误差1.272180.071由表2可知，4个因素对发酵产物的影响程度依次为接种量含水量发酵温度发酵时间。由表3可知，在不考虑交互效应的情况下，接种量、含水量、发酵温度、发酵时间均对发酵产物的粗蛋白含量有极显著影响（P0.01）。综合得出最优发酵条件参数为：接种量8%、含水量50%、发酵温度31 ℃、发酵时间84 h。2.3银杏叶固态发酵效果的评价银杏叶固态发酵蛋白饲料的营养价值见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.017.T004表4银杏叶固态发酵蛋白饲料的营养价值组别粗蛋白粗纤维粗灰分粗脂肪总黄酮总氨基酸发酵前12.0118.2115.938.951.178.04发酵后24.288.0723.7410.771.0511.28%由表4可知，在接种量8%、含水量50%、发酵温度31 ℃、发酵时间84 h的条件下，发酵产物呈棕褐色，质地细腻，无霉味，粗蛋白、粗灰分、粗脂肪、总氨基酸含量分别提高102.16%、49.03%、20.34%、40.30%，粗纤维、总黄酮含量降低55.68%、10.26%，相比发酵前更适合作为饲料使用。3讨论银杏叶除含有黄酮类化合物和萜内酯类化合物等有效成分以外，含有银杏酸等毒性成分[10]。因此，在畜禽养殖中利用银杏叶时，常利用传统炮制法、中药配伍脱毒法或提取其有效成分，但这些方法稳定性差、成本高，都不适合在生产中应用[11]。利用微生物对中草药进行发酵是开发利用新型饲料资源的有效方法。相比液态发酵，固态发酵具有操作简便、产量高、低能耗等特点，既可以保留中草药的活性成分，又不会造成污染[12-13]。利用微生物发酵银杏叶，可以将银杏叶的有效成分保留下来，还可以降低银杏酸等毒性成分的含量[14-15]。而在发酵过程中，银杏叶可以促进微生物的次生代谢，从而产生新的活性物质，提高发酵产物的利用价值[16-17]。因此，本试验对固态发酵银杏叶生产蛋白饲料的工艺进行探讨。结果表明，最佳工艺参数为接种量8%、含水量50%、发酵温度31 ℃、发酵时间84 h，这与前人的研究结果相似[18-19]。在此条件下对其发酵产物的营养价值进行测定，发现银杏叶固态发酵产物的粗蛋白、粗灰分、粗脂肪、总氨基酸含量与未发酵时相比分别提高102.16%、49.03%、20.34%、40.30%，而粗纤维、总黄酮含量降低55.68%、10.26%，说明固态发酵提高银杏叶的营养成分，降低畜禽难以消化的粗纤维，对总黄酮等银杏叶的主要活性成分影响大，使其更适合在畜禽生产中应用[16]。4结论本试验结果表明，利用地衣芽孢杆菌固态发酵银杏叶生产蛋白饲料的最佳工艺参数为接种量8%、含水量50%、发酵温度31 ℃、发酵时间84 h。经固态发酵后，银杏叶的粗蛋白、粗灰分、粗脂肪、总氨基酸含量分别提高102.16%、49.03%、20.34%、40.30%，粗纤维、总黄酮含量降低55.68%、10.26%。