在水产养殖中,可以使用益生菌防止病原体发展,提高水产动物的抗病能力[1],其中应用较为广泛的是孢子形成的细菌,主要是枯草芽孢杆菌[2-3]。枯草芽孢杆菌是一种理想的多功能益生菌,具有部分替代抗生素的潜力。枯草芽孢杆菌代谢产物具有增强机体免疫力,提高饲料转化率,改善养殖环境,抑制氧化应激等多种功能[4]。枯草芽孢杆菌可在大部分碳源和氮源中生长,主要是因为枯草芽孢杆菌中的酶可以分解动植物的蛋白质、碳水化合物和复合脂类[5]。文章综述枯草芽孢杆菌的抗菌活性物质及其对水产动物抗病力的具体作用机制,以期为枯草芽孢杆菌在水产养殖中的进一步应用提供参考。1枯草芽孢杆菌的抗菌活性物质枯草芽孢杆菌分泌的抗菌物质主要分为两大类:一类是枯草芽孢杆菌核糖体产生的抗菌蛋白,主要含有细菌素、酶类与一些未鉴定的抗菌肽;另一类是非核糖体产生的脂肽类化合物[6-8]。1.1抗菌蛋白1.1.1抗菌肽抗菌肽(AMPs)存在于宿主免疫系统,可能是一种可替代传统抗生素的抗菌蛋白[4]。从发酵食品中分离得到的枯草芽孢杆菌CSB138产生的肽p138c,能够与苯唑西林、氨苄西林或青霉素G发挥协同作用,使其杀菌能力增加4~8倍,是一种有效的杀菌组合[9]。抗菌肽具有广谱抗菌活性和独特的膜作用机制,在生产中可替代抗生素的使用[10],还可以通过增强抗菌肽的杀菌能力减少抗生素的使用[11]。Taghiyeva[12]将枯草芽孢杆菌ATCC6633与5株革兰氏阴性菌、5株革兰氏阳性菌一起培养,发现枯草芽孢杆菌ATCC6633具有明显的拮抗作用,抑制了葡萄球菌、无乳链球菌的生长。Luan等[13]从金环蛇毒液中分离提取出一种抗菌肽,利用蛋白纯化技术(SUMO技术)在枯草芽孢杆菌中表达抗菌肽,纯化的SUMO蛋白酶具有高活性,并以1∶40的酶与底物比切割his-SUMO-CBF,切割后进一步纯化,达到了约3 mg/L无内毒素的CBF,并且该肽表现出抗菌活性。1.1.2细菌素细菌素(bacteriocin)是由核糖体产生,并在细胞外释放具有生物活性的抗菌肽[14-15]。Cavara等[16]认为,细菌素可以作为抗生素的有效替代品。研究表明,枯草芽孢杆菌产生的细菌素和类细菌素抑制物质(BLISs)可有效抑制病原菌[17]。研究表明,细菌素的抗菌机制与传统的广谱抗生素存在很大区别[18]。Yi等[19]在枯草芽孢杆菌中检测到细菌素和抗菌次生代谢产物,其相关基因包括3个PKS基因簇、4个细菌素基因簇和5个NRPS基因簇。研究表明,枯草芽孢杆菌纯化的细菌素对革兰氏阳性表皮葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌表现出广泛的抗菌活性,最小抑菌浓度分别为1.44、2.88 g/L[20]。研究发现,从土壤中分离的枯草芽孢杆菌中部分纯化的细菌素可抑制表皮葡萄球菌的生长[21]。研究发现,从土壤中分离的枯草芽孢杆菌KKU213具有抗菌活性和益生菌特性,并且含有枯草芽孢杆菌KKU213培养物的无细胞上清液(CFS)对革兰氏阳性菌具有抑制作用[22]。因此,产细菌素的枯草芽孢杆菌KKU213可用作潜在的益生菌菌株或保护性培养物。1.1.3酶类枯草芽孢杆菌可产生具有不同底物特异性和抗菌特性的水解酶,这些裂解酶具有抗菌活性。枯草芽孢杆菌分泌的几丁质酶具有降解几丁质的能力,可用作抗植物病原真菌的生物杀菌剂和防治害虫的杀虫剂[23]。枯草芽孢杆菌产生的几丁质酶对马铃薯丝核菌病具有良好的防治能力[24]。Chen等[25]将含有环状芽孢杆菌WL-12 chiA基因的DNA片段连接到穿梭载体pHY300PLK,并转化到枯草芽孢杆菌F29-3中,结果发现,与枯草芽孢杆菌对照菌株相比,表达chiA基因的枯草芽孢杆菌F29-3对椭圆葡萄孢菌中的孢子萌发具有较强的抑制作用,表明枯草芽孢杆菌F29-3分泌的几丁质酶具有抗真菌的功能。枯草芽孢杆菌在RNA聚合酶的控制下产生一种新型自溶素LytG,其主要是肽聚糖结构中的氨基葡萄糖苷酶[26]。LytG是一种具有外酶活性的新型氨基葡萄糖苷酶,并且可能构成新型自溶素家族的一部分,能够参与细胞的裂解和运动。1.2脂肽类化合物1.2.1表面活性素表面活性素(surfactin)是一种环状脂肽类物质,具有抑制细菌、病毒和支原体生长以及作为生物表面活性剂等功能[27]。Pinkas等[28]研究发现,枯草芽孢杆菌可以产生一种环状脂七肽,是一种表面活性抗菌剂。环脂肽的抗菌活性主要表现为与细胞膜相互作用和破坏细胞膜渗透性的能力,可以改变细胞膜的表面张力,形成孔隙,最终触发细胞凋亡。研究表明,新型天然环状脂七肽化合物具有修饰结构,在生物防治中应用具有较大的潜力[29]。研究表明,枯草芽孢杆菌根据不同竞争者可产生不同的表面活性素同系物[30]。与化合物高度敏感的真菌共培养时,环脂肽产量先增加后减少;与中度敏感的真菌共培养时,环脂肽产量增加较缓慢,可能是由于其孢子萌发速度较慢;与耐受性真菌根茎根霉共培养时,枯草芽孢杆菌在相互作用期间产生大量环脂肽。环脂肽产生量的变化可以解释为病原体对细菌脂肽的整体敏感性和植物病原体与枯草芽孢杆菌之间的相对生长速率。Giri等[31]从枯草芽孢杆菌VSG4和地衣芽孢杆菌VS16中分离的生物表面活性剂,可应用于食品和生物医学领域的天然抗氧化剂、抗菌剂和抗黏剂,存在于枯草芽孢杆菌细胞外表面活性剂中的表面活性素在抗菌过程中起到重要作用。1.2.2伊枯草菌素伊枯草菌素(iturin)是枯草芽孢杆菌产生的一种代谢产物,具有广谱的抗菌作用[4]。付云等[32]研究表明,从枯草芽孢杆菌发酵液中分离出的伊枯草菌素对金黄色葡萄球菌具有抑菌作用。研究发现,枯草芽孢杆菌WL-2可抑制致病菌株的生长,其功能代谢物经电喷雾电离质谱(ESI-MS)鉴定为伊枯草菌素[33]。研究表明,伊枯草菌素可以诱导细胞结构破坏、氧化应激和能量供应功能障碍,从而在抑制致病菌发挥作用[34]。1.2.3泛革素泛革素(fengycin)是一种脂肽类物质,对多种丝状真菌具有明显的抑制作用。有研究克隆了枯草芽孢杆菌Bs916中合成泛革素的完整操纵子,通过生物信息学分析和生化试验鉴定了泛革素的5种变异体的化学结构,结果表明,脂肽泛革素是枯草芽孢杆菌Bs916抗真菌活性的重要因子之一[35]。程晓莹[36]研究表明,枯草芽孢杆菌分泌的脂肽性化合物中的泛革素可在一定程度上提高鸡局部黏膜先天性体液免疫水平。有研究从菲律宾蛤仔中分离并鉴定一种泛素(ubiquitin),该泛素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出较高的抗菌活性[37]。2枯草芽孢杆菌对水产动物抗病力的影响研究2.1抗菌蛋白对水产动物抗病力的影响研究枯草芽孢杆菌中的抗菌蛋白对水产有害微生物具有抑制作用。Guo等[38]通过基因测序和生化测试鉴定了11株源自草鱼肠道的枯草芽孢杆菌,表明枯草芽孢杆菌具有潜在的抗炎能力;根据4种已表征的枯草芽孢杆菌菌株的生理特性,其中的一种或多种菌株可能具有在水产养殖中作为益生菌使用的潜力。Cheng等[39]研究发现,枯草芽孢杆菌E20发酵豆粕(FSBM)可产生对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有很强抗菌活性的抗菌肽;枯草芽孢杆菌E20发酵豆粕中的抗菌肽通过与细菌膜的相互作用抑制弧菌的生长,从而增加其渗透性;将E20-FSBM加入至白虾、凡纳滨对虾的饵料中,结果表明,枯草芽孢杆菌E20-FSBM可能是一种生物功能成分,可防治虾类养殖中的弧菌病。Han等[40]研究表明,枯草芽孢杆菌具有预防鱼类VHSV感染的潜力。因此,枯草芽孢杆菌不仅能够在水产养殖中作为益生菌使用,还有可能作为一种抗病毒治疗剂对抗不同的病毒感染。2.2脂肽类化合物对水产动物抗病力的影响研究枯草芽孢杆菌能够分泌类似抗生素的多肽类物质,可以直接或间接抑制病原菌生长,提高水产动物的免疫力。脂肽类化合物是枯草芽孢杆菌重要的抗菌物质。马艺萌等[41]研究表明,枯草芽孢杆菌HS-301对黄曲霉素具有抑制作用,其提取物可以开发并作为新型生物防霉剂。Shi等[42]研究表明,枯草芽孢杆菌可以调节草鱼肠道免疫反应、脂肪代谢,几乎所有的脂质代谢相关基因均明显上调,定时荧光定量PCR筛选出11个脂质代谢相关基因,大部分筛选出的基因,尤其是载脂蛋白B-48(Apob-48)、ABCG8和二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的表达均增加[43]。Deng等[44]研究发现,枯草芽孢杆菌的发酵产物AMPNT-6是一种抗菌脂肽,具有破坏生物膜的能力,并且具有明显的抗黏附作用。Giri等[45]从枯草芽孢杆菌VSG4中分离出生物表面活性剂,并评估其对露斯塔野鲮的免疫刺激作用,结果发现,枯草杆菌VSG4对免疫应答具有积极影响,能够增强机体的抗病能力,刺激免疫相关基因的表达。枯草芽孢杆菌能够加快饵料中营养素的降解,使水产动物充分利用饵料中的营养成分。芽孢杆菌进入胃肠道后,约有70%~80%的复活概率,可以产生蛋白质、多肽以及维生素等多种营养物质,能够与有害菌产生拮抗作用,抑制有害菌生长,从而显著提高了动物的抗病力。枯草芽孢杆菌可以促进动物生长发育,提高动物免疫力,而且具有无毒副作用、无残留、原生态等特性[4]。3展望益生菌可以改善鱼的健康情况,减少抗生素使用,抑制细菌性疾病。芽孢杆菌在水产养殖中具有很大的应用潜力,有助于鱼类的绿色养殖,还可以防治病原菌感染的疾病。枯草芽孢杆菌具有丰富的抗菌活性,能够抑制多种水产养殖、植物和动物病原体。但目前益生菌的开发还不完全,许多益生菌和水产动物之间的相互作用在分子的层面研究还不够充分。需要进一步研究枯草芽孢杆菌的抗菌活性物质对鱼类病原体的作用机制,以及枯草芽孢杆菌产生的抗菌化合物与水产动物体内免疫刺激之间的关系。许多枯草芽孢杆菌产品的使用效果还受环境等因素的影响,菌株的筛选方法以及作用条件仍需进一步探究。未来对这些菌株还需要深入研究,以更好地了解添加枯草芽孢杆菌对水产动物的抗病效果。
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