近年来，水产养殖业不断扩大，鱼粉需求量增加，但鱼粉价格较高，需要寻找价格低廉、能够稳定供应可替代鱼粉的优质蛋白源。豆粕来源广泛，价格低，氨基酸较为平衡，蛋白质消化率较高，成为替代鱼粉的首选植物蛋白原料。但豆粕存在多种抗营养因子，利用豆粕高比例替代鱼粉会对水产动物的健康造成伤害[1-2]。研究表明，微生物发酵可以降解豆粕中的抗营养因子，提升豆粕的营养价值[3-4]。乳酸菌属于益生菌，能够在动物肠道定植，产生有机酸、过氧化氢、各种酶类、乳酸菌素等物质，具有很好的抑菌作用，可以促进动物体生长[5-6]。乳酸菌发酵豆粕能够产生乳酸、丙氨酸等芳香物质，提高发酵原料风味，增加适口性和营养价值，提高动物的生长性能[7-9]。发酵可以降低豆粕中抗营养因子含量，增加游离氨基酸的含量[2,10-12]。发酵菌种和发酵工艺对发酵豆粕的品质具有重要影响[13-16]。本试验以本实验室菌种库中的来源水产动物肠道和养殖环境的9株乳酸菌为研究对象，筛选出发酵潜力良好的乳酸菌，为生产水产功能性发酵豆粕提供参考。1材料与方法1.1试验菌种试验9株菌株均由本实验室菌种库提供，乳酸菌菌株名称和来源见表1。所有菌株均以25%甘油为保护剂保存于-80 ℃冰箱中。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.015.T001表1乳酸菌菌株名称及来源中文名称拉丁文名称编号来源德氏乳酸杆菌Lactobacillu delbrueckiiWbm3斜带石斑鱼肠道乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.mm3斜带石斑鱼肠道格氏乳球菌Lactococcu garvieaea鳜鱼肠道乳酸乳球菌Lactococcus lactis17小丑鱼肠道乳球菌Lactococcus petauriLd3鲈鱼肠道乳球菌Lactococcus petauriMZ鳗鲡肠道鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosusshu养殖环境布氏乳杆菌Lactobacillus buchneribu养殖环境哈尔滨乳酸杆菌Lactobacillus harbinensislac养殖环境1.2菌株的活化与传代从-80 ℃冰箱取出乳酸菌菌种，以200 μL的乳酸菌菌液接种至50 mL MRS液体培养基（青岛海博生物技术有限公司）中，于30 ℃、150 r/min恒温摇床培养24 h。活化的菌液以5%接种量接种至MRS液体培养基，再活化一次，培养条件为30 ℃、150 r/min，培养24 h。1.3测定指标及方法1.3.1乳酸菌生长曲线将活化的菌液以5%接种量接种至液体培养基中，30 ℃、150 r/min进行培养，采用分光光度计比浊法测定菌液在0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33 h的吸光度（OD600 nm），绘制乳酸菌的生长曲线。1.3.2乳酸含量取已经传代的乳酸菌菌液2 mL，4 000 r/min离心20 min，取上清液。设置未接种菌体的MRS液体培养基作为空白对照。使用乳酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定培养液中乳酸含量。1.3.3豆粕固体发酵豆粕经粉碎过筛，筛选粒径为250~830 μm的豆粕，用于后续发酵试验。取活化后的乳酸菌菌液以5%接种量进行传代两次，根据菌株的生长曲线，取第二次传代的最佳生长期菌液作为发酵种子液。调整各菌株发酵种子液，以10%接种量（干基接种量）接入灭菌的生理盐水，加入1%葡萄糖（干基），混匀，接入豆粕，此时基质中含水量为50%，即达到1∶1的物料比，使开始发酵前豆粕中各乳酸菌浓度为2.25×104 CFU/g。液体加入时需搅拌均匀，8层纱布封瓶口，使用牛皮纸包扎瓶口，30 ℃恒温恒湿培养箱发酵48 h，每组试验重复3次。1.3.4发酵豆粕的感官评价观察发酵豆粕的颜色，嗅其气味，用手捏发酵豆粕感觉其黏度。1.3.5大豆抗原蛋白定量测定采用酶联免疫法测定发酵豆粕及普通豆粕中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量，均使用北京龙科方舟生物工程技术有限公司的试剂盒进行定量测定。1.4数据统计与分析试验数据采用Microsoft Excel 2013作初步处理，SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.19株乳酸菌的生长曲线（见图1）由图1可知，鼠李糖乳杆菌shu和布氏乳杆菌bu在生长9 h左右进入对数生长期，但在33 h内仍未达到平台期。格氏乳球菌a有将近长达15 h的生长调整期，在生长时间为18 h左右进入对数生长期。其余6株菌株均在9 h前进入对数生长期，33 h内达到了生长平台期。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.015.F001图19株乳酸菌的生长曲线2.2乳酸菌的乳酸产量（见表2）由表2可知，培养24 h后，哈尔滨乳酸杆菌lac、乳酸乳球菌17、乳球菌MZ和乳球菌Ld3培养液中乳酸含量均超过10 mmol/L，其中乳酸乳球菌17产乳酸能力最强，为15.28 mmol/L。德氏乳杆菌Wbm3和乳酸乳球菌mm3产生的乳酸菌含量分别为1.25、1.43 mmol/L。布氏乳杆菌bu、鼠李糖乳杆菌shu和格式乳球菌a产乳酸的量均低于1 mmol/L，因此，不进入后期菌株复筛阶段。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.015.T002表2乳酸菌的乳酸产量菌株乳酸乳酸乳球菌mm31.43±0.03哈尔滨乳酸杆菌lac13.92±0.22乳酸乳球菌1715.28±0.93乳球菌MZ10.83±0.11乳球菌Ld311.81±0.09德氏乳杆菌Wbm31.25±0.02布氏乳杆菌bu0.30±0.01格氏乳球菌a0.82±0.03鼠李糖乳杆菌shu0.42±0.04mmol/L2.3乳酸菌发酵豆粕感官评价结果（见表3）由表3可知，乳酸乳球菌17发酵豆粕颜色呈黄色，气味具有浓郁芳香味，具有一定黏度，与其他乳酸菌发酵豆粕比较，感官评价更具优势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.015.T003表3乳酸菌发酵豆粕感官评价结果菌株结果乳酸乳球菌mm3发酵豆粕黄色，无氨味，有黏度哈尔滨乳酸杆菌lac发酵豆粕黄色，芳香味，有黏度乳酸乳球菌17发酵豆粕黄色，浓郁芳香味，有黏度乳球菌MZ发酵豆粕黄色，芳香味，无黏度乳球菌Ld3发酵豆粕黄色，芳香味，有黏度德氏乳杆菌Wbm3发酵豆粕黄色，无氨味，有黏度2.4乳酸菌发酵豆粕大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量结果（见表4）由表4可知，与其他乳酸菌相比，乳球菌MZ对豆粕中大豆球蛋白的降解性能最差，降解率仅为8.45%。其余乳酸菌对豆粕中大豆球蛋白降解率均超过20%，乳酸乳球菌17降解效果最佳，达37.29%。乳酸乳球菌17对豆粕中的β-伴大豆球蛋白降解率为24.49%，其余菌株对豆粕中的β-伴大豆球蛋白降解能力较弱，降解率均低于10%，其中德氏乳杆菌Wbm3未对豆粕中的β-伴大豆球蛋白进行降解。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.015.T004表4乳酸菌发酵豆粕大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量菌株大豆球蛋白β-伴大豆球蛋白普通豆粕（对照）146.39±3.05a121.01±1.57ab乳酸乳球菌mm3发酵豆粕115.50±1.80c112.95±0.92c哈尔滨乳酸杆菌lac发酵豆粕100.03±2.47d116.99±2.95bc乳酸乳球菌17发酵豆粕91.79±2.64e91.37±1.24d乳球菌MZ发酵豆粕134.01±2.59b116.90±0.98bc乳球菌Ld3发酵豆粕116.41±2.06c118.94±2.08ab德氏乳杆菌Wbm3发酵豆粕115.29±1.58c123.78±1.72a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）。mg/g3讨论3.1乳酸菌生长曲线分析发酵过程中，处于对数生长期的菌体通常被用作种子发酵液，原因是处在对数生长期菌体的繁殖能力最强，选用此阶段的菌体作为种子发酵液可以缩短菌株进入发酵培养基的调整适应时间。本试验中，鼠李糖乳杆菌shu和布氏乳杆菌bu在生长9 h左右进入对数生长期，但在33 h内仍未达到平台期，表明鼠李糖乳杆菌shu和布氏乳杆菌bu生长期较长；格氏乳球菌a有将近长达15 h的生长调整期，在生长时间为18 h左右进入对数生长期，表明格氏乳球菌a生长调整期较长；其余6株菌株均在9 h前进入对数生长期，33 h内达到了生长平台期。因此，除了鼠李糖乳杆菌shu、布氏乳杆菌bu和格氏乳球菌a，其余6株乳酸菌均能够以较短时间进入对数生长期，表明这6株菌株适应能力强，生长状态好。3.2乳酸菌产乳酸能力分析产乳酸能力是考量乳酸菌发酵潜力的重要指标，发酵饲料中的乳酸可以提高饲料适口性及质量[17]。饲料中添加有机酸可以控制pH值，抑制微生物在饲料中的生长繁殖[18]，改善动物抗氧化能力，增强机体免疫能力，调整养殖动物肠道菌群结构[19-20]。杜刚等[21]通过Plackett-Burman试验技术，确定了酵母提取物、糖蜜、碳酸钙的最优组合培养基，使乳酸产量达到了145.53 g/L。另外，还可以通过调控底物、温度变化及时间提高乳酸产量[22-23]。本研究中，哈尔滨乳酸杆菌lac、乳酸乳球菌17、乳球菌MZ和乳球菌Ld3培养液中乳酸含量超过10 mmol/L，表明这些菌株具有良好的产乳酸能力。3.3乳酸菌发酵豆粕的感官评价分析发酵豆粕的感官评价可以从颜色、气味、黏度进行评估[24]。颜色能够间接反映发酵程度，发酵的产品以黄色或浅黄褐色最好。气味以具有芳香味，无豆腥和很浓重的氨味为优。发酵过程中产生的小分子物质会增加原料的黏度。本研究中，乳酸乳球菌17发酵豆粕的颜色、气味和黏度均为最佳，颜色呈黄色，具有浓郁的芳香味，具有一定黏度，优于其他组。3.4乳酸菌发酵豆粕抗营养因子分析大豆抗原蛋白是豆粕中主要的抗营养因子[25]。由于抗原蛋白结构有二硫键，能够维持蛋白的结构强度，不易被破坏，在饲料加工过程难以去除。动物消化过程中，抗原蛋白亲水性碱基通过聚合隐藏酶切位点，使其不能被降解而残留在动物体内，影响动物的消化吸收，导致饲料利用率下降，生长缓慢。水产动物，特别是肉食性鱼类对豆粕抗原蛋白很敏感，高剂量抗原蛋白容易导致“豆粕型”肠炎[26]。发酵豆粕能够去除豆粕中的抗营养因子[24,27]。刘海燕[10]研究发现，乳酸菌能够显著降低豆粕抗原蛋白的含量。石慧等[28]研究发现，乳酸菌能够降解部分β-伴大豆球蛋白，但对大豆球蛋白无明显降解作用。Frias等[11]研究发现，植物乳杆菌能够分泌蛋白酶，以液态发酵的方式降解豆粕中的抗原蛋白。魏炳栋等[12]研究发现，通过乳酸菌固态发酵豆粕，其蛋白质含量比对照组提高约4%，体外消化率提高约6%，必需氨基酸含量增加约24倍，氨基酸总含量提高约45倍。因此，不同乳酸菌菌株对大豆抗原蛋白的降解能力及营养价值的提升存在差异。本研究中，乳酸乳球菌17对大豆抗原蛋白降解能力最强，大豆球蛋白含量由发酵前146.39 mg/g降低至发酵后91.79 mg/g；β-伴大豆球蛋白含量由发酵前121.01 mg/g降低至发酵后91.37 mg/g。4结论9株水产乳酸菌中，乳酸乳球菌17综合发酵潜力最佳，在培养12 h左右进入对数生长期，传代培养24 h后乳酸含量达15.28 mmol/L，乳酸乳球菌17发酵的豆粕感官品质优良，且大豆球蛋白降解率37.29%，β-伴大豆球蛋白含量降解率为24.49%。