苜蓿为一年生豆科植物，其中紫花苜蓿（Medicago sativa L.）被誉为“牧草之王”，具有根瘤固氮、抗逆性强、营养价值高等特点，因其富含蛋白质，是奶牛等草食家畜的重要蛋白饲草[1-2]。苜蓿中还含有丰富的黄酮类、酚醛酸等生物活性物质。其中，黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗病原微生物、提高免疫力等重要作用[3-4]。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是研究豆科植物器官发育、根瘤菌的共生系统、生物和非生物胁迫的重要品种，而蒺藜苜蓿与紫花苜蓿的基因组高度相似，研究蒺藜苜蓿抗逆相关基因的功能成为揭示紫花苜蓿基因调控的重要方式[1,5]。目前关于非编码RNA参与植物调控主要包括miRNA（microRNA）、lncRNA（long non-coding RNA）、circRNA（circular RNA）。其中苜蓿miRNAs已被广泛挖掘，miRBase数据库（https://www.mirbase.org/index.shtml）已收录Medicago truncatula 672个前体miRNAs序列以及756个成熟miRNAs序列。尚骁尧等[6]使用单分子长读数测序技术（single-molecule long-read sequencing technology，SMRT）对蒺藜苜蓿进行全长转录组测序及分析，与蒺藜苜蓿参考序列中已经注释的9 676个lncRNAs进行对比分析，发现通过SMRT鉴定出92个已知的lncRNAs和6 503个新lncRNAs。何馨竹[7]对天蓝苜蓿进行特定的RNA测序，预测出110条circRNAs。文章将从苜蓿非编码RNA对苜蓿生理功能调节（生长发育、生物胁迫和非生物胁迫）方面阐述苜蓿miRNAs的相关研究及未来的潜在性应用，为更好地利用非编码RNA的生物技术培育高品质、高产量及高营养价值的苜蓿品种提供参考。1非编码RNA简介非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是一类不编码蛋白的RNA，包括tRNA（transfer RNA）、rRNA（ribosomal RNA）、snoRNA（small nucleolar RNA）、miRNA、lncRNA和circRNA等。miRNAs是一类长约18~24个核苷酸的内源性非编码单链小RNA片段，属于一种转录后水平的调控因子[8]。2002年首次在拟南芥中发现了植物miRNAs，其作用方式主要是使靶mRNA降解，从而抑制mRNA的翻译[9-11]。miRNAs广泛参与植物在环境胁迫（盐碱、干旱、虫害及病害的侵扰）、种子发育、花发育、株型等方面的调控[12-13]。2002年，Okazaki等[14]在小鼠cDNA文库测序中首次发现了lncRNAs的存在。植物中最早发现的lncRNAs为蒺藜苜蓿中的enod40[15]。lncRNAs表达丰度比mRNAs低，并且具有较强的组织和细胞表达特异性，在多个水平层面参与调控蛋白编码基因的表达，对真核生物细胞分化、个体发育等生命过程的基因表达调控起重要作用[16-17]。circRNA是另一类lncRNA[18]，是一类由基因间、基因的内含子或基因外显子反向剪接形成，并输送到细胞质中的闭环类单链RNA[19]，具有高度保守性，并且不易被降解[20]，于20世纪70年代在植物病毒体中首次被发现[21]。还有部分circRNA是由未离体的内含子套索产生，这些circRNA被优先定位在细胞核中[19]。circRNA广泛参与植物生物胁迫与非生物胁迫及生长发育等方面的调控[22-23]。植物circRNA直接或间接通过结合miRNA来竞争性抑制miRNA对靶基因的调控，具有翻译蛋白的潜质、参与转录调控及RNA结合蛋白等方面发挥生物学作用[22,24]。2苜蓿ncRNAs对其生理功能的调控苜蓿ncRNAs在苜蓿生长的各个方面均发挥着重要作用。研究表明，miRNAs、lncRNAs和circRNAs在植物多个方面发挥重要作用，包括苜蓿植株的组织（花、叶、根等）分化及形态、生长发育、生物和非生物胁迫（盐碱、干旱、金属元素等）等方面。因此，基于苜蓿ncRNAs调控机制的深入研究对于获取高品质的苜蓿具有重要意义。苜蓿中非编码RNA功能作用见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.026.T001表1苜蓿中非编码RNA功能作用非编码RNAs功能及其靶向基因文献来源miR-156开花延迟，改变毛状体形态从而抵御害虫，增加果胶多糖含量，降低纤维含量，可能提高植物的耐盐性，抗旱（SPL13与WD40-1）Aung等[25]、Lei等[26]、王依纯[27]、Feyissa等[28]miR-319叶片形态发育（TCP2、TCP3、TCP4、TCP10和TCP24）曹春雨[1]miR-166根瘤组织发育（HD-ZIPIII）李巍[29]enod40、ncRNA TAS3根瘤组织发育Boualem等[30]、Charon等[31]、Traubenik等[32]miR-169根瘤组织发育（MtHAP2-1）、秋眠Combier等[33]、Reynoso等[34]、杜红旗等[35]、樊文娜等[36]miR-172根瘤组织发育（AP2 TFs），可能提高植物的耐盐性Combier等[33]、Reynoso等[34]miR-167降低花粉活性张家驹等[37]miR-5272b监控病虫侵害王依纯[27]miR-395、miR-398、lncRNA TCONS_00020253耐盐曹春雨[1]、王依纯[27]、Wang等[38]lncRNA PDIL1参与磷缺乏的胁迫反应（miR-399 MtPHO2）Wang等[39]lncRNA MTCIR1低温胁迫（MtCBF）Zhao等[40]miR-159抗旱（MYB）Abe等[41]、Chen等[42]miR-5754调控动物癌症的发生（MALAT1）Marzano等[43]2.1miRNAs对苜蓿生长发育的调控miRNAs对苜蓿生长发育方面的调控主要表现在开花时间、叶片形态、根瘤组织形成、种子休眠等方面。研究发现，MsmiR-156的过表达对苜蓿的开花时间产生影响，对照苜蓿植株在繁殖后135 d开始开花，而基因型A16、A8a和A8中miR-156丰度增加了840倍，开花延迟3~5 d，基因型A17和A11a中miR-156丰度增加了1 200倍以上，开花延迟了45 d以上[25]，同时GmmiR-156b可能靶向SPL同源基因，负调控GmSPLs，从而延缓大豆在低温和自然条件下的开花[44]。miR-319通过靶向调控TCP2（TEOSINTE BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF2）、TCP3、TCP4、TCP10和TCP24，参与调控延缓植物叶片衰老，并对植物叶片形态产生一定的影响[45-46]。mtr-miR-319可通过靶向MtTCP4使得苜蓿叶片发生卷曲从而影响叶片发育[1]。miR-169和miR-172分别靶向MtHAP2-1和AP2TFs的表达来调节共生根瘤组织的生长发育[33-34]。miR-166靶向HD-ZIPIII对苜蓿侧根和根瘤的形成产生影响[30]。在表达MsmiR-156的转基因苜蓿中也发现了增强的毛状体密度和毛状体延长[25]，并且毛状体可以提供抵御害虫的物理屏障[47]。miR-156过表达可以对苜蓿细胞壁果胶产生影响，基因型A8a和A11的果胶水平降低了6%~9%，但在其他转基因苜蓿基因型中发现果胶水平增加了5%[25]，提高苜蓿中果胶多糖的含量，可用于高效捕获苜蓿蛋白[48]。紫花苜蓿中miR-156过表达降低了苜蓿的纤维含量，体外发酵试验发现过表达miR-156可以增加干物质的降解[26]。Charon等[31]在过表达enod40的转基因蒺藜苜蓿中，植物表现出根尖区域增殖速度加快，并且根长增加结瘤样结构，而具有减少enod40转录物的植物仅形成少数结瘤样结构。苜蓿中lncRNA TAS3可能充当捕获miR-390的目标模拟物，有助于减少干扰生长素反应因子的产生并调节结节形成和根瘤菌感染[32]。苜蓿lncRNA 167和苜蓿miR-167c超表达后会降低植物花粉活力，植株下胚轴显著增长，超表达植株在盐和干旱胁迫下可提高植物发芽率[37]。Wang等[39]研究发现，在对苜蓿幼苗进行缺磷处理后，lncRNA PDIL1抑制miR-399靶向的MtPHO2降解，PDIL2和PDIL3通过互补结合直接抑制磷转运蛋白基因MtPHO2的表达，因此PDILs可以调节磷缺乏信号和磷转运，突出了lncRNAs参与调节植物对磷缺乏的反应。2.2miRNAs对苜蓿生物胁迫的作用植物在生长发育过程中病害和虫害等生物危害会影响植物的产量和品质，因此研究苜蓿miRNAs对生物胁迫的影响是预防和提高苜蓿产量和病害的新方法。目前，关于苜蓿在生物胁迫方面的研究报道较少。王依纯[27]在南方型紫花苜蓿和其耐盐突变体中发现miR-5272b差异表达，并且预测的靶基因主要与抗病性相关，可参与监控病虫侵害，动员植物抵抗外界不利因素。2.3miRNAs对苜蓿非生物胁迫的作用在不同的生存环境下，植物具有不同的生长特性，这是由于植物在抵抗外界不利因素做出的一系列应对机制，从而使得植物正常生长发育，其中盐渍、干旱、低温、重金属等非生物性胁迫是苜蓿生长发育过程中重要的环境因素。2.3.1盐胁迫调控盐胁迫是由于土壤中所含盐离子差异，植物为正常生长而抵抗的外界环境因素。通过农杆菌介导法使mtr-miR-319和mtr-miR-395分别在拟南芥中超表达，并对拟南芥叶片伤口进行侵染获取转基因拟南芥，随后对野生型拟南芥和转基因拟南芥进行盐处理，发现Mtr-miR-319转基因拟南芥中的含水量明显高于野生型，相对含水量几乎没有变化，而在Mtr-miR-395转基因拟南芥中无论含水量还是相对含水量均高于野生型。在脯氨酸的测定中发现，在盐处理后Mtr-miR-319和Mtr-miR-395转基因拟南芥中的脯氨酸都出现了累积上升的情况，并且均高于野生型拟南芥，其中Mtr-miR-395转基因拟南芥高于Mtr-miR-319转基因拟南芥，表明Mtr-miR-395转基因拟南芥在盐处理下具有更强的保水能力，并且更耐盐[1]。盐胁迫前后，南方紫花苜蓿及其突变体中的miR-398a、miR-156b以及miR-172家族差异表达显著，表明miRNAs可能通过靶向特定的基因提高苜蓿的抗盐性[27]。Medina等[49]鉴定了苜蓿在干旱和高盐环境中circRNAs和lncRNAs的多样性，鉴定出11 677个lncRNAs和2 108个非冗余的circRNAs，其中有2 105个lncRNAs差异上调和1 894个lncRNAs差异表达下调。在蒺藜苜蓿中，参与渗透和盐胁迫的12个lncRNA的表达已得到验证，lncRNA TCONS_00020253正向调控Medtr1g081900（Na+/H+ex-changer（NHX）），从而提高苜蓿耐盐性[38]。2.3.2低温调控秋眠性是苜蓿在秋季适应环境变化所表现出的一种特性，与产量和抗寒性相关。相关的研究发现，PHYA（phytochrome A）和PHYB（phytochrome B）可能通过光受体对光周期调控影响了脱落酸和赤霉素等激素的合成进而调控了秋眠基因的表达，诱发了秋眠[35-36]。miR-169通过参与紫花苜蓿转录因子HAP2信号转导来调控秋眠，进而影响植株的高度和产量[50]。李巍[29]通过转录组测序分析发现紫花苜蓿在低温和寒冷胁迫下，获得了35个差异表达的mRNAs基因，其中有83%的miRNAs（29/35）在低温或寒冷胁迫影响下表达量下调，例如，miR-156、miR-159、miR-169、miR-396和miR-398等。Zhao等[40]对苜蓿幼苗进行冷处理后，在根和叶中发现了组织特异性冷反应lncRNA，其中lncRNA（LNC_016398-MtCIR1）和7个CBF基因位于抗冻性QTL区域6号染色体上，此外lncRNA MtCIR1的转录水平在暴露于低温后2 h内增加，然后在5 h内积累MtCBFs，表明MtCBFs和MtCIR1之间存在调节网络，因此lncRNA MtCIR1与其潜在的靶MtCBF基因整合，可能在植物对冷胁迫的反应和适应中发挥关键作用。2.3.3干旱胁迫调控在干旱环境条件下叶片形态的变化是重要指标，植物对水分胁迫包括多胺代谢、活性氧清除机制、激素调控等[40]。李跃[51]通过高通量测序分析从根系和叶片中分别筛选出18和12个干旱胁迫性应答miRNAs，其中根系中的miRNAs有16个miRNAs是表达下调的，这些miRNA包括miR-396、miR-159、miR-160、miR-482、miR-1507、miR-166、miR-156和miR-398家族。miR-159靶向MYB家族，在干旱胁迫下，MYB对ABA信号转导通路具有正向调控作用[41-42]。miR-398靶基因主要与呼吸和活性氧胁迫相关[52-53]。miR-156通过调节下游靶基因SPL13与WD40-1来帮助紫花苜蓿抵抗干旱胁迫[28]。2.3.4金属离子胁迫金属离子胁迫主要是因为使用含有重金属离子化肥或杀虫剂，使一些重金属离子进入土壤中，从而引起植物生长发育不良甚至死亡，因此研究金属离子对植物的胁迫作用，对植物抗逆具有重要的研究意义。周兆胜[54]采用20 μmol HgCl2处理蒺藜苜蓿24 h，发现叶片中miR-393表达上调，而miR-166和miR-395的表达下调，但miR-160、miR-171a、miR-319、miR-398和miR-529的表达丰度基本不变。李海波[55]利用基因芯片分析发现，在汞胁迫下蒺藜苜蓿存在323个miRNAs靶标，其中140个差异表达，其中根中118个，叶中49个，这些差异表达的基因主要涉及转录因子、抗疾病蛋白以及一些跨膜蛋白等。何馨竹[7]对高钙处理前后的天蓝苜蓿进行了转录组数据分析后检测出110条circRNAs，并通过靶基因预测软件发现的ath-miR-854、ath-miR-5652以及ath-miR-398与其存在互作关系，这些miRNAs已被证明在非生物胁迫中差异表达。3外源性miRNA的调控研究发现，大约有60%的基因受miRNAs的调控[56-57]。miRNAs不仅参与内源性的调节，还可通过采食进入动物体内而发生跨物种调控。苜蓿中含有的生物活性因子在癌症及炎症方面具有重要作用。因此，研究苜蓿miRNAs跨物种调控功能具有重要意义。3.1外源性miRNAs稳定性植物miRNA进入动物体内途径是随植物被摄食进入动物体内，在肠道进行吸收，被细胞外囊泡尤其是外泌体包被后，随血液循环到达不同部位发挥作用[58-59]。老鼠饲喂大米之后，在老鼠血液中检测到植物miRNA的存在。如miR-168a在蒸煮之后miRNA具有一定的稳定性[58]，例如在将大豆进行蒸煮之后，miRNAs表达量稳定，但在经过特殊加工形成豆乳和豆腐之后，miRNAs表达量降低[56]。gma-miR-159a和hsa-miR-16在4、37 ℃下使用RNaseA处理10 min后，发现gma-miR-159a和hsa-miR-16表达量都降低，但gma-miR-159a降低幅度没有hsa-miR-16大，表明植物miRNAs相比较内源性miRNAs具有抵抗RNase的作用[56]。植物miRNAs能在动物体内稳定存在的原因包括：（1）植物miRNAs的特殊结构即3'末端的2'-O-甲基化结构[60]；（2）一级结构（如高G、C含量）也有助于miRNA抵抗RNase酶的消化[61]；（3）miRNA和RNA结合蛋白，如高密度脂蛋白[62]和AGO蛋白[63-64]可防止miRNAs降解；（4）运输过程中，植物miRNAs被细胞外囊泡包被，从而保护不被降解[58]。3.2苜蓿miRNA的功能性调控目前，对于苜蓿miRNAs跨界调控的研究较少，主要在大豆[56]、金银花[65]、水稻[58]等植物方面的调控作用。苜蓿跨界调控的研究主要是对癌症的影响，例如Marzano等[66]在2 588个人类miRNAs中，发现1 606个显示其种子序列与3 172个植物miRNAs的5'端完全匹配，然后根据人类靶基因或miRNA在细胞周期调节（癌症和肿瘤）中的作用，选择了20种人类miRNAs作为7种植物miRNAs的潜在功能类似物，在转染结直肠癌HCT116细胞系72 h后有446个基因差异表达，证明了苜蓿miR-5754（mtr-miR-5754）可直接靶向MALAT1来调控癌症的发生。苜蓿含有丰富的miRNAs，而苜蓿miRNAs在跨物种调控方面的作用具有很大的潜力，因此挖掘苜蓿miRNAs的跨界调控作用具有重要意义。4展望苜蓿是一种具有经济价值的牧草，在干旱或盐渍化的土地种植、培育新品种，不仅可提高苜蓿产量也可充分利用土地资源。由于物种的差异性，不同植物对外界的适应不同。例如紫花苜蓿耐盐性较蒺藜苜蓿耐盐性高，因此不同的植物品种对外界适应性需要进行深入研究，以培育出适应性较强、产量高的优良品种。但苜蓿中的ncRNAs影响其蛋白含量及生物产量的机制尚未阐明，因此未来对苜蓿进行深入研究具有重要意义。