木聚糖酶是一类复合酶系，以内切-β-1，4-D-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）为主，可将植物纤维中的木聚糖降解成低聚木糖和少量木糖。小麦中的阿拉伯木聚糖其含量在5.27%~8.18%之间，约是玉米中阿拉伯木聚糖的2倍[1-2]。木聚糖酶添加到麦型饲料中可以很好地消除小麦中高含量的阿拉伯木聚糖抗营养因子。木聚糖在单胃动物胃肠道内形成黏性凝胶，导致食糜黏度增加，影响饲料中营养物质的消化和吸收；外加木聚糖酶则可以降低食糜黏度，改善动物生产性能[3]。目前，以木聚糖酶为主的所谓小麦酶已在饲料行业得到广泛应用。黑曲霉以其安全、产酶活性高[4]、木聚糖酶酶系齐全[5]、生产工艺简单、生产成本低廉等特点，用于生产木聚糖酶仍然显示出优势。微生物发酵过程中常采用不同阶段实施不同温度发酵的方法。冯昱宁[6]研究槐糖脂变温发酵的菌体培养、变温时间点以及产物发酵温度，发现变温操作相比恒温发酵的最高产量提高28.8%。赵晓行[7]以γ-聚谷氨酸的最高比生产速率为指标对其变温发酵条件进行研究，采用阶梯式温度调节控制方案，获得最大产量为42.27 g/L，相对37 ℃恒温发酵提高10.1％。本研究旨在探究黑曲霉产生木聚糖酶的最佳温度条件以提高木聚糖酶产量，为其应用于木聚糖酶酶制剂的生产提供依据。1材料与方法1.1菌种黑曲霉A-25为河南农业大学酶工程实验室通过诱变育种获得的木聚糖酶高产菌株。1.2培养基PDA斜面培养基与察氏培养基：参考文献周德庆等[8]的方法。麸皮产酶培养基（w/v）：玉米芯2%、麸皮2%、草酸铵1%、葡萄糖0.1%、吐温80 0.15%、CaCO3 0.6%，pH值5.0。可溶性产酶培养基（w/v）：木聚糖0.5%、KH2PO4 0.7%、K2HPO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、(NH4)2SO4 0.1%、酵母浸膏0.06%，pH值5.0。1.3粗酶液的制备将斜面培养基上生长5~6 d的黑曲霉分生孢子加入无菌水中制备孢子悬液，取1 mL接入液体培养基中220 r/min振荡培养，发酵液通过4层纱布过滤，滤液4 ℃、4 200 r/min离心10 min，上清即为粗酶液。1.4木聚糖酶活力木聚糖酶活力测定方法及酶活力单位定义参考Zhu等[9]的方法。1.5菌丝体生物量菌丝体生物量的测定参考邹莉等[10]的方法测定菌丝湿重。1.6聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测木聚糖酶酶谱发色底物雷马素马斯亮蓝（RBB）-木聚糖的制备参考Yin等[11]的方法，RBB-木聚糖琼脂糖板的制备参考Hrmova等[12]的方法。PAGE电泳检测木聚糖酶谱带：PAGE电泳的浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为8%。电泳完毕后，取下凝胶并与RBB-木聚糖琼脂糖板上的胶片贴紧，置于保鲜盒中在40 ℃保温反应1 h，可以观察到透明的木聚糖酶谱带，配制脱色液（pH值5.4的0.05 mol/L醋酸缓冲液∶95%乙醇=1∶1）浸泡RBB-木聚糖琼脂糖板脱色3~20 h，即可观察到清晰的木聚糖酶酶谱。2结果与分析2.1温度对黑曲霉A-25生长的影响采用液体察氏培养基，分别在29、31、33、35 ℃温度下培养黑曲霉A-25并测定其生物量，分析温度对菌体生长的影响，结果见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.016.F001图1不同温度下黑曲霉A-25的生物量由图1可知，在不同温度下，黑曲霉A-25菌丝生物量都随着培养时间延长而增加，其中特别是33 ℃下菌体生长早期的菌丝量增加最快，48 h时的生物量比29 ℃下高60%左右。因此，33 ℃是黑曲霉A-25生长的最适温度。2.2温度对黑曲霉A-25产木聚糖酶的影响在27、29、31、33 ℃不同温度下采用产酶培养基进行产酶试验，装液量为100 mL/250 mL三角瓶、接种量3%，220 r/min下培养110 h，每隔8 h取样测酶活力，结果见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.016.F002图2温度对黑曲霉A-25产酶的影响由图2可知，发酵前48 h产酶量较低，48 h后产酶量急剧加快；29 ℃下发酵96 h时木聚糖酶活力达到最大值610 IU/mL，为该菌株最佳产酶温度；而33 ℃下产酶周期最短，72 h即可达到产酶峰值。2.3不同变温操作对黑曲霉A-25产酶的影响本试验表明，29 ℃下培养有利于菌体产酶，而33 ℃培养可以有效促进菌体生长，因此可对黑曲霉进行变温操作，发酵前期采用33 ℃培养，发酵后期降温为29 ℃进行产酶。黑曲霉接种麸皮产酶培养基，并以32、48、64 h为变温点进行产酶试验，结果见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.016.F003图3变温操作对黑曲霉A-25产酶的影响由图3可知，变温点为64 h时酶活达到最高点的时间最短（80 h），但产酶量较低；变温点为32 h和48 h时的产酶峰值相当，但后者比前者到达产酶峰值的时间提前8 h。综合产酶周期和产酶峰值两个因素，33 ℃下培养48 h再变温为29 ℃是最佳的产酶方案。在上述最佳变温产酶条件与29 ℃恒温产酶情况进行对比，结果见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.016.F004图4变温和恒温操作产酶曲线图由图4可知，29 ℃恒温产酶最高酶活力610 IU/mL，所需时间为96 h；变温产酶条件下88 h达到产酶峰值，最高酶活力为721 IU/mL，相比29 ℃恒温培养最高酶活力提高18%，且产酶周期缩短8 h。2.4变温和恒温发酵下单位质量菌丝体产酶的比较采用可溶性产酶培养基探索变温提高黑曲霉产酶活力的原因，对黑曲霉A-25分别进行29 ℃恒温发酵以及33 ℃培养48 h后降温至29 ℃变温发酵，结果见表1。由表1可知，变温发酵时黑曲霉菌丝体生物量比恒温发酵要高，尤其在48 h之前更为显著；整个产酶周期，单位质量菌丝体的产酶能力在变温条件下比恒温条件下要高。因此，通过变温操作提高木聚糖酶活力的原因有单位质量菌丝产酶能力提高和菌丝生物量增加两个因素。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.016.T001表1变温和恒温发酵对单位质量菌丝产酶能力的影响时间/h变温33 ℃(48 h)-29 ℃恒温29 ℃酶活力/(IU/mL)菌丝质量/(g/mL)单位质量菌丝产酶量/(IU/g)酶活力/(IU/mL)菌丝体量/(g/mL)单位质量菌丝产酶量/(IU/g)24150.1015040.04100481180.22536720.15480723930.341 1552840.29979964700.341 3823960.321 2382.5变温和恒温发酵条件下木聚糖酶酶谱分析取黑曲霉A-25变温发酵和恒温发酵48 h的粗酶液，测定其木聚糖酶酶谱，见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.016.F005图5变温发酵和恒温发酵条件下木聚糖酶酶谱注：1为变温发酵48 h的木聚糖酶酶谱；2为恒温发酵48 h的木聚糖酶酶谱。由图5可知，恒温发酵48 h的粗酶液只有XynⅠ和XynⅡ 2条木聚糖酶的谱带，而变温发酵48 h时的粗酶液则有XynⅠ、XynⅡ和XynⅢ 3条木聚糖酶的谱带；变温条件下的木聚糖酶XynⅠ、XynⅡ表达量相比恒温条件明显提高。3讨论本研究发现，变温发酵能显著提高黑曲霉A-25木聚糖酶的产量，这种方法在工业发酵方面操作简单、成本低廉，非常具有推广的价值。在黑曲霉菌丝生长阶段采取33 ℃的较高温度可以促进菌体的快速生长，在较短的时间内获得较大的菌体生物量；而发酵后期降低温度至29 ℃可以延缓菌体的衰老，有利于产酶。本研究发现，变温操作导致木聚糖酶活力提高的原因为菌丝量的增加以及单位质量菌丝体产酶能力的提高。酶谱分析表明，变温条件下产酶能力的提高主要是因为木聚糖酶XynⅠ、XynⅡ的表达量增加。本课题组前期对黑曲霉A-25产木聚糖酶酶谱检测得知，29 ℃恒温发酵84 h时木聚糖酶XynⅠ、XynⅡ和XynⅢ均有表达[13]。由此可以推测，木聚糖酶XynⅢ在变温条件下比恒温条件下的表达时间要早，也有可能木聚糖酶XynⅢ在恒温条件48 h时的合成量较低而无法检测到。已有变温操作相关文献中只是对发酵产物量、进行研究，并没有通过酶谱水平上或基因水平进行深入探讨机理[6-7,14-17]。Wei等[18]在吸水链霉菌5008的发酵过程中通过温度转换提高有效霉素A（VAL-A）的产生，进一步研究发现，其结构基因的转录水平得到了有效提高，活性氧（ROS）信号可能在温度变化过程中有助于VAL-A的产生。在本研究中，变温操作如何影响木聚糖酶XynⅠ、XynⅡ的表达量和XynⅢ的提前合成，还需要对这3个木聚糖酶结构基因及其调节基因从转录水平进行定量分析。4结论黑曲霉A-25在变温条件下可以提高木聚糖酶产量。黑曲霉在不同温度下培养，33 ℃培养时获得最大的菌丝体生物量，而在29 ℃培养时获得最高木聚糖酶产量；采用33 ℃培养、48 h后降为29 ℃的变温条件进行木聚糖酶发酵，木聚糖酶最高活力可达721 IU/mL，比29 ℃恒温发酵提高18%，同时发酵周期缩短8 h。进一步研究变温发酵提高酶活力的机理，发现0~48 h阶段内采用33 ℃培养可使黑曲霉菌丝体生物量明显增加，并且单位质量菌丝体的产酶能力也有不同程度的提高；木聚糖酶的酶谱分析表明变温发酵促进木聚糖酶XynⅢ的提前表达，同时提高木聚糖酶XynⅠ和木聚糖酶XynⅡ的表达量。