豆粕中蛋白含量高，常用来作为水产饵料中的植物性蛋白源，但豆粕中含有胰蛋白酶抑制因子、非淀粉多糖和植物血凝素等抗营养因子，会降低饲料蛋白质消化率，影响水产动物的健康生长[1]。豆粕经发酵或酶解处理后，能够去除酶解豆粕中的抗营养因子，将大豆蛋白水解为更容易被机体利用的小分子肽类物质，产生对动物具有积极作用的活性物质，提高豆粕的营养价值[2]。在对虾养殖中，加入适量酶解豆粕可以提高对虾机体免疫力，且对生长性能无明显影响[3-4]。发酵酶解豆粕可作为日本沼虾饵料中较好的蛋白质来源[5]。酶解豆粕对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的蛋白质合成及代谢具有促进作用，可调节脂肪蓄积，提高幼鱼抗氧化能力[6]。酶解豆粕替代鱼粉对大口黑鲈的生长性能和消化酶活性均具有较好的促进作用[7]。目前，克氏原螯虾是我国淡水养殖产量最大的甲壳动物[8]。克氏原螯虾商业饵料中鱼粉的使用量较低，大多数以植物蛋白源满足其蛋白质需求，但克氏原螯虾对植物蛋白源的利用率并不高[9]。肠道是虾类重要的消化器官，由复杂的微生物生态系统构成，能够吸收动物摄取食物中的蛋白质、脂肪等，肠道微生物能够影响宿主的生长发育、免疫调节功能以及对营养物质的代谢能力[10]。肠道中有益菌、有害菌共同存在，从而实现体内的动态平衡。虾类动物中不同肠道微生物在体内互利共生，又相互制约[11]。外源因素的改变会导致肠道菌群结构改变，如温度[12]、病原[13]、养殖模式[14]和生长阶段[15]等。目前，饵料中添加酶解豆粕对克氏原螯虾肠道微生物菌群的影响尚不清楚。本研究以克氏原螯虾为研究对象，分析不同比例酶解豆粕饵料对克氏原螯虾生长及肠道微生物菌群的影响，为酶解豆粕在克氏原螯虾及其他虾类饵料中的利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料克氏原螯虾于2021年11月10日购自辽宁省沈阳市八家子水产市场。酶解豆粕、矿物质预混料和维生素预混料由沈阳市波尔莱特饲料有限公司提供。1.2试验设计选取300只健康、体重（26.30±3.19）g的克氏原螯虾，随机分为4组，平均置于12个带有循环水系统的玻璃水槽中（90 cm×50 cm×70 cm），每组3个水槽，每个水槽25只虾。试验A组（对照组）克氏原螯虾投喂基础饵料，豆粕添加量36%，试验B组、C组、D组分别使用36%、40%、44%酶解豆粕替代基础饵料中豆粕及鱼粉。饵料原料过20目筛，部分原料经9FC-28齿爪式粉碎机粉碎，称重，混匀，投入颗粒饲料压制机，得到直径为2.5 mm颗粒，置于50 ℃的精宏XMTD-8222烘干箱中2 h，烘干水分，密封保存。试验饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.009.T001表1试验饵料组成及营养水平项目A组（对照组）B组C组D组原料组成鱼粉101062肉粉10101010豆粕36000面粉17171717小麦麸14141414米糠7777豆油4444矿物质预混料（磷酸二氢钙）1111维生素预混料1111酶解豆粕0364044合计100100100100营养水平水分5.674.965.025.73粗蛋白质35.8637.1236.4435.77粗脂肪8.168.028.237.89粗灰分7.457.367.586.95注：营养水平均为实测值。%1.3饲养管理试验在沈阳农业大学水生动物养殖实验室进行，暂养稳定2周。每天10：00、17：00各投喂一次，投喂量为0.5%克氏原螯虾体重的饵料，投喂2 h后排污换水，换水量约为1/2。试验期6周。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验期间，每2周对克氏原螯虾进行一次称重，试验结束，计算克氏原螯虾的增重率、特定生长率、存活率、饵料系数、蛋白质效率、肝体比。增重率(WGR)=(末重-初重)/初重×100%(1)特定生长率(SGR)=100%×(ln末重-ln初重)/饲养时间(2)存活率(SR)=试验结束克氏原螯虾的数量/试验开始克氏原螯虾的数量×100%(3)饵料系数=消耗的饲料干物质的量/(末重-初重)(4)蛋白质效率(PER)=(生长后体质量平均值-生长前体质量平均值)/蛋白质摄入量×100%(5)肝体比=肝胰重/体重×100%(6)1.4.2肠道微生物试验结束后，分别从每个水槽随机选取3只虾，在无菌环境下，将每个水槽的3只虾肠道混入1个2 mL冻存管中，置于液氮中保存，用于后续肠道微生物测定。将肠道样品送至上海派森诺基因科技有限公司进行DNA提取和测序，DNA质检合格后，采用PCR扩增菌群16S rDNA基因的V3V4区序列，使用引物F：5'ACTCCTACGGGAGCACA-3'，R：3'GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5'。采用Illumina平台对群落DNA片段进行双端（Paired-end）测序，切除序列的引物片段，弃去未匹配引物的序列，调用DADA2进行质控，去噪，拼接，去嵌合体。在97%相似度水平对高质量序列聚类，使用RDP FrameBot软件，对核酸序列中的插入和缺失错误进行纠正，获得校正的核酸序列和蛋白序列。利用QIIME2软件与参考序列数据库进行比对，计算样本Alpha多样性指数，以Chao1和Observed species指数表征丰富度，以Shannon和Simpson指数表征多样性，以Goods_coverage指数表征覆盖度，计算Beta多样性。1.5数据统计与分析采用SPSS Statistics 26.0对数据进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1酶解豆粕对克氏原螯虾生长性能的影响（见表2）由表2可知，D组克氏原螯虾的增重率、特定生长率均显著低于其他组（P0.05），B组和C组克氏原螯虾的增重率和特定生长率均显著高于对照组（P0.05）。B组和C组克氏原螯虾的饵料系数显著低于对照组（P0.05），C组克氏原螯虾的蛋白质效率显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.009.T002表2酶解豆粕的添加对克氏原螯虾生长性能的影响组别初重/g末重/g存活率/%增重率/%特定生长率/(%/d)饵料系数蛋白质效率/%肝体比/%A组（对照组）26.54±3.0927.59±3.31b58.00±2.83a3.98±0.81b0.09±0.02b248.71±48.34a1.15±0.22b4.87±1.02B组26.18±3.4427.79±3.23a42.00±2.83b6.14±1.46a0.14±0.03a153.92±34.58b1.80±0.40ab4.59±0.58C组26.36±3.3928.32±3.08a36.00±5.66b7.44±0.75a0.17±0.01a114.17±10.71b2.41±0.23a4.62±1.65D组26.11±2.8227.08±3.02c22.00±2.83c3.61±0.70c0.09±0.01b206.46±30.10ab1.37±0.20b4.89±1.32注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2肠道微生物样本高通量测序结果（见表3、图1）由表3可知，经16S rDNA测序，共得到869 750条有效序列。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.009.T003表3不同样本克氏原螯虾肠道细菌的序列数量统计样本原始序列去除低质量去噪后序列拼接后序列高质量序列过滤序列A1117 468111 584109 682101 68079 48379 172A2115 641110 112108 173104 32370 81070 380A3108 714102 297100 17296 24884 17883 838B1128 003118 555116 121111 40572 93672 265B2107 979102 082100 64698 24974 01773 753B3121 382115 237113 920112 16282 99282 740C198 49093 61792 23190 01461 43161 196C2101 32192 08789 86586 24564 97964 537C3105 128100 18898 44096 22369 41069 072D1104 19798 50196 83194 15473 76773 572D2103 98198 51496 73593 64166 09865 558D3114 799105 424102 72898 24169 64968 975由图1可知，克氏原螯虾肠道样品一共产生5 609个OTU，不同组间共有246个OTU。D组独有OTU数最高，B组与C组均小于对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.009.F001图1克氏原螯虾肠道微生物群落组成Venn图2.3肠道微生物菌群多样性分析（见图2、图3）由图2可知，所有样品的Goods_coverage均在0.996 7以上，表明本次测序中各组样品微生物种类均被检测。酶解豆粕对克氏原螯虾肠道微生物的丰富度和多样性没有显著影响（P0.05）。随着酶解豆粕替代比例的升高，克氏原螯虾肠道Chao1指数、Observed_species指数均呈升高趋势，物种丰富度升高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.009.F002图2酶解豆粕对克氏原螯虾肠道微生物Alpha多样性的影响由图3可知，A组与C组肠道菌群存在显著性差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.009.F003图3A组、C组克氏原螯虾肠道微生物Alpha多样性指数2.4酶解豆粕对克氏原螯虾肠道菌群门水平组成的影响（见图4）由图4可知，在门水平下，A组、B组、C组、D组中克氏原螯虾肠道变形菌门（Proteobacteria）分别占35.47%、26.41%、24.79%、33.64%。D组克氏原螯虾肠道拟杆菌门（Bacteroidetes）在克氏原螯虾肠道菌群中的相对丰度最高（41.06%）。C组克氏原螯虾肠道柔膜菌门（Tenericutes）相对丰度最高（37.87%）。B组克氏原螯虾肠道厚壁菌门（Firmicutes）最高（22.72%）。变形菌门、拟杆菌门、柔膜菌门、厚壁菌门在A组、B组、C组、D组分别占98.47%、98.82%、97.03%、98.62%，在克氏原螯虾肠道菌群中占据绝对优势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.009.F004图4酶解豆粕对克氏原螯虾肠道菌群门水平组成的影响2.5克氏原螯虾属水平聚类分析（见图5）由图5可知，在属水平，克氏原螯虾肠道微生物聚为两大分支，A组、D组聚为一支，B组、C组聚为一支。B组、C组志贺氏菌属（Shigella）、副球菌属（Paracoccus）、Uliginosibacterium的丰度高于A组、D组。B组、C组金黄杆菌属（Chryseobacterium）、弓形杆菌属（Arcobacter）丰度明显低于A组、D组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.009.F005图5克氏原螯虾属水平聚类分析2.6克氏原螯虾的肠道微生物的菌群丰度差异分析（见图6）由图6可知，A组、D组克氏原螯虾肠道微生物螺状菌属（g_Runella）、硝化螺旋菌门（p_Nitrospirae）、蟑螂杆状体科（f_Cryomorphaceae）、韦荣氏球菌科（f_Veillonellaceae）的丰度具有明显差异。D组中韦荣氏球菌科丰度最高，A组中螺状菌属丰度最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.009.F006图6克氏原螯虾肠道微生物的菌群丰度差异分析3讨论鱼粉是水产养殖饲料中优质的蛋白源，但鱼粉存在其价格昂贵、供给短缺等问题，需要寻找替代鱼粉的蛋白质饲料[16]。酶解和发酵豆粕是水产饲料中常用的植物性蛋白源，其蛋白含量高，利于水产动物生长，是理想的植物蛋白[17]。3.1酶解豆粕对克氏原螯虾生长性能的影响添加发酵豆粕能够提高刺参的生长速度[18]。杨长庚等[19]发现，使用不同蛋白源替代鱼粉时，发酵豆粕组能够明显提高克氏原螯虾的增重率，与本试验结果相似。酶解豆粕能够改善豆粕品质，符合克氏原螯虾的生长需要。但不同添加量酶解和发酵豆粕对不同水产动物的生长指标影响不同。刘慧玲等[3]研究发现，投喂25%和50%酶解豆粕蛋白替代鱼粉，对凡纳滨对虾的增重率、特定生长率、饲料系数和蛋白质效率等无明显影响。在含10%鱼粉的饵料中添加0~5.5%酶解豆粕对凡纳滨对虾的生长性能改善效果不明显[4]。饵料中使用酶解豆粕替代40%的鱼粉，石斑鱼幼鱼的特定生长率显著提高，替代80%的鱼粉石斑鱼幼鱼的特定生长率和蛋白质效率显著降低[6]。本研究中，36%和40%酶解豆粕添加组中的克氏原螯虾增重率、特定生长率明显升高，蛋白质效率在40%酶解豆粕添加组中最高；当添加量为44%时，体质量、增重率等生长性能及存活率均明显下降，饵料中过量的酶解植物蛋白会对动物的生长产生不利影响[19]。添加8%~12%发酵豆粕替代鱼粉能够明显影响凡纳滨对虾的成活率，过高水平的发酵豆粕替代鱼粉会影响凡纳滨对虾的特定生长率[20]。3.2酶解豆粕对克氏原螯虾肠道微生物多样性的影响肠道菌群能够影响甲壳动物宿主的生长发育、营养消化和免疫调节功能等[21-22]。罗氏沼虾肠道细菌丰度和多样性受饵料中发酵豆粕和大豆抗原蛋白的影响较大[23]。本研究中，4组共同OTU仅占总OTU数的0.04%，除共有OTU外，还存在相当数量的特有OTU。研究表明，随饵料中酶解豆粕比例升高，克氏原螯虾肠道微生物菌群种类越复杂。本试验中，4组克氏原螯虾肠道Alpha多样性指数差异不显著。发酵豆粕替代鱼粉对大口黑鲈幼鱼肠道微生物Alpha多样性指数无显著影响[24]。本试验中，40%酶解豆粕组肠道菌群多样性显著高于对照组，表明添加40%酶解豆粕更利于提高克氏原螯虾肠道微生物的丰富度和多样性。3.3酶解豆粕对克氏原螯虾肠道菌群组成的影响变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）是虾肠道的核心菌门[10]。本研究表明，4组虾的肠道微生物菌落在门水平上主要为变形菌门、拟杆菌门、柔膜菌门（Tenericutes）和厚壁菌门组成。变形菌门是细菌中较大的门类，是虾类肠道中最丰富的细菌菌门，但虾类潜在疾病很大程度上受其丰度影响，肠道变形菌门比例升高会增加虾类患疾病的风险[22]。本研究中，对照组和高酶解豆粕添加组肠道变形菌门丰度最高，36%和40%添加组丰度相对较低，推测过量添加酶解豆粕会提高克氏原螯虾病原微生物丰度。厚壁菌门是革兰氏阳性菌，是克氏原螯虾的主要有益菌，能够促进肠上皮中脂肪的吸收，还可为动物肠黏膜细胞提供营养物质，在调节机体消化吸收起关键作用[25]。本试验中，4组克氏原螯虾肠道厚壁菌门/拟杆菌门分别为0.79、0.83、0.56、0.24，当酶解豆粕比例为36%时最高。Mountfort等[26]认为，厚壁菌门能够促进动物肠道内容物分解及代谢，产生为肠道细胞能量代谢提供来源的小分子糖类和脂肪酸。适量的酶解豆粕可以调节克氏原螯虾肠道内细菌比例，使肠道微生物菌群呈健康状态。柔膜菌门是维持甲壳动物健康生长的重要菌类[22]。本研究发现，36%和40%酶解豆粕组柔膜菌门丰度均高于36%豆粕（对照）。弧菌属是水产动物体内常见的致病菌，对动物体生长具有抑制作用。本研究中，44%酶解豆粕组克氏原螯虾肠道弧菌属丰度最高，表明添加过高量的植物性蛋白不利于克氏原螯虾的生长。4结论本试验条件下，酶解豆粕添加比例在36%~40%，克氏原螯虾的生产性能最佳，酶解豆粕添加量过高，会使克氏原螯虾肠道有害菌比例升高，生长性能下降。