紫苏属于薄荷家族唇形科紫苏属，是一种具有特殊香气的一年生草本植物，紫苏叶、紫苏茎和紫苏籽在传统中医中均可入药[1-2]。紫苏是一种营养丰富的药食两用植物[3]，紫苏叶含有黄酮、咖啡酸和迷迭香酸等活性成分[4]，具有抗氧化、抗过敏、抑菌、抗肿瘤等功能[5]，紫苏叶中的黄酮含量可达10%以上（不同地区和环境或存在差异）[6]。紫苏黄酮是紫苏提取物中的主要活性成分，紫苏提取物能够提高动物对营养物质吸收效率、机体抗氧化能力和免疫力[7-9]。王珍珊等[10]研究发现，在育肥猪的基础日粮中添加4.0%紫苏和苜蓿复合植物提取物可以提高育肥猪的生长性能，改善胴体品质。张勇等[11]研究发现，基础日粮中添加1 000 mg/kg紫苏籽提取物可提高江香猪仔猪的免疫功能，改善生长性能。因此，紫苏叶提取物在动物生产中具有广泛的应用前景。目前，从植物中提取黄酮的方法包括溶剂浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和酶提取法等[12-14]。其中微波辅助提取法具有操作简单、提取时间短、效率高等优点[6]。但目前关于紫苏提取物的研究多集中在紫苏籽[15]，对紫苏叶黄酮的提取工艺优化及其体外抗氧化活性的研究相对较少。本研究旨在研究微波辅助法的不同工艺条件对紫苏黄酮提取率的影响，测定紫苏黄酮提取物的体外抗氧化性能，以期为优化紫苏黄酮的提取工艺提供参考。1材料与方法1.1试验材料与试剂紫苏叶购自亳州仁益中药材销售有限公司（产地安徽亳州）。将新鲜紫苏叶经过简单清洗，剔除杂质，在恒温烘箱中60 ℃烘4 h，粉碎机粉碎，过40目筛，分装密封，-20 ℃冰箱中保存。芦丁标准品购自四川普西奥标物科技有限公司（HPLC≥98.0%）。无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、DPPH、硫酸亚铁等化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司（分析纯）。i-Series LC-2050/2060液相色谱仪（岛津公司）、R-1020 20L旋转薄膜蒸发器（广州市京邦电子科技有限公司）、Pico17离心机（赛默飞世尔科技）、ME204E电子分析天平（梅特勒托利多集团）、GZY-PA60-Y超纯水机（南京科尔仪器设备有限公司）。1.2测定指标及方法1.2.1黄酮含量本研究以芦丁为标准品，采用比色法测定提取物中黄酮总含量[16-17]，于510 nm波长处测量吸光度，计算紫苏叶中的黄酮提取率（y）。y=c×vm×100% (1)式中：c为提取液中黄酮的质量浓度（mg/L）；v为提取液体积（mL）；m为紫苏叶质量（mg）。1.2.2标准曲线绘制以甲醇为溶剂，配制1 g/L芦丁标准溶液，随后依次配制1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0和0.062 5 g/L标准溶液，使用25 mL容量瓶定容。将不同浓度的标准溶液置于510 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。1.2.3单因素试验初始条件为：准确称取紫苏叶粉末2.0 g，置于平底烧瓶中，加入体积分数70%乙醇溶剂，在功率为200 W微波下提取30 min，乙醇与紫苏叶的液料比为15 mL/g。待液体冷却至室温，6 000 r/min离心10 min，取上清液检测提取液的吸光度。在上述条件基础上，依次考察乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）、微波功率（100、150、200、250、300 W）、提取时间（5、10、15、20、30 min）对紫苏叶中黄酮提取效果的影响。1.2.4正交试验设计根据单因素试验结果，设计3因素3水平的L9（34）正交试验[18]，确定紫苏叶的最优黄酮提取工艺条件。L9（34）正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平乙醇浓度/%微波功率/W提取时间/min1702001528025020390300301.2.5紫苏黄酮提取物体外抗氧化活性1.2.5.1DPPH·清除能力取不同浓度（0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 g/L）紫苏黄酮溶液各2.5 mL置于试管中，加入2.5 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L），摇匀，密封，室温下避光反应30 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液，检测其在波长517 nm处的吸光度，记为Ai；将2.5 mL紫苏黄酮样品和2.5 mL无水乙醇混合，检测吸光度Aj；将2.5 mL DPPH与2.5 mL无水乙醇混合，检测吸光度A0。每次检测吸光度均重复测定3次取均值。计算紫苏黄酮的DPPH·清除率（RDPPH·）。以相同浓度维生素C（VC）清除率作为对照。RDPPH·=1-Ai-AjA0×100% (2)1.2.5.2OH·清除能力在试管中依次加入1.0 mL 8.0 mmol/L硫酸亚铁溶液，不同浓度的紫苏黄酮溶液样品1.5 mL，1.0 mL 8.0 mmol/L过氧化氢溶液，摇晃均匀，静置10 min，加入1.0 mL的8.0 mmol/L水杨酸溶液，摇匀，37 ℃水浴锅中静置30 min，离心取上清液，检测其在536 nm波长处的吸光度，记为A1；以1.5 mL蒸馏水替代样品溶液作为对照，吸光度为A2；以等体积蒸馏水（2.5 mL）替代样品和过氧化氢溶液作为空白对照，吸光度为A0。计算紫苏黄酮的OH·清除率（ROH·）。以相同浓度VC的清除率作为对照。ROH·=A1-A2A0-A2×100% (3)1.2.5.3·O2-清除能力参考茹巧美等[19]·O2-清除能力检测方法，略有改动。在试管中添加6.0 mL Tris-HCl（50.0 mmol/L，pH值8.2），25 ℃水浴20 min，加入2.0 mL不同浓度的紫苏黄酮溶液，添加0.8 mL的5.0 mmol/L邻苯三酚溶液，摇匀，25 ℃水浴4 min，使用0.2 mL HCl溶液（8 mol/L）终止反应，检测其在320 nm处的吸光度Ai；以70%聚乙二醇溶液替代样品溶液作为空白组，吸光度为A0；以蒸馏水替代邻苯三酚作为对照组，吸光度为Aj。计算紫苏黄酮的·O2-清除率（R·o2-）。以相同浓度VC的清除率作为对照。R·o2-=1-(Ai-Aj)/A0×100%(4)1.3数据统计与分析采用SPSS 26.0对所有数据进行汇总、整理和分析，采用SPSS软件中的GLM模型对标准曲线进行拟合。2结果与分析2.1芦丁样品的标准曲线（见图1）由图1可知，拟合线的回归方程为y=0.630 8x+0.005 6，R2=0.999 6，表明拟合效果较好，方程可用于后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.F001图1芦丁样品的标准曲线2.2单因素试验结果2.2.1乙醇浓度对紫苏叶中黄酮提取率的影响（见图2）由图2可知，随着乙醇溶剂添加浓度逐渐提高，紫苏叶中黄酮的提取率也随之提高，当乙醇浓度为80%时，提取率达到最大，继续增大乙醇浓度，提取率反而下降。紫苏叶中黄酮的最大提取率为4.53%。因此，选取70%、80%和90%乙醇浓度作为后续正交试验的参数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.F002图2乙醇浓度对紫苏叶中黄酮提取率的影响2.2.2微波功率对紫苏叶中黄酮提取率的影响（见图3）由图3可知，随着微波功率逐渐提高，紫苏黄酮提取率呈先升高后下降的趋势。在微波功率达到250 W时，紫苏黄酮的提取率达到最大（4.21%）。因此，选取200、250和300 W的微波功率进行后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.F003图3微波功率对紫苏叶中黄酮提取率的影响2.2.3提取时间对紫苏叶中黄酮提取率的影响（见图4）由图4可知，随着提取时间延长，紫苏叶中黄酮提取率呈先增后减的趋势。提取时间为20 min时，紫苏黄酮的提取率达到最大值4.98%。因此，选取15、20、30 min的提取时间进行后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.F004图4提取时间对紫苏叶中黄酮提取率的影响2.3正交试验及方差分析结果（见表2、表3）由表2可知，根据R值得出影响紫苏黄酮提取率因素排序为：乙醇浓度提取时间微波功率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.T002表2正交试验结果项目乙醇浓度微波功率提取时间黄酮含量/(μg/g)11114.2021223.9331334.4842134.9352214.9062324.4573123.8083234.3893314.33K112.6112.9313.42K214.2813.2212.18K312.5113.2613.79k14.204.314.47k24.764.414.06k34.174.424.60R0.590.110.54由表3可知，乙醇浓度对紫苏黄酮提取率具有极显著影响（P0.01），提取时间对苏黄酮提取率具有显著影响（P0.05），而微波功率对苏黄酮提取率无显著影响（P0.05）。综合考察极差分析和方差分析的结果，取各因素中k值最大为最优参数，从苏黄叶中提取黄酮的最优工艺参数分别为：乙醇浓度80%（k2）、微波功率300 W（k3）和提取时间30 min（k3）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值截距172.4841172.48464 413.2780.000**乙醇浓度0.65920.330123.0660.008**微波功率0.02120.0113.9380.203提取时间0.47620.23888.8840.011*误差0.00520.003注：1.R²=0.995，F0.05（2，2）=19，F0.01（2，2）=99。2.“*”表示影响显著（P0.05），“**”表示影响极显著（P0.01）。2.4优化试验结果按照上述优化条件进行6次重复试验，检测其紫苏黄酮的提取率。紫苏叶黄酮提取率见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.T004表4紫苏叶黄酮的提取率项目123456平均值黄酮提取率5.115.295.295.275.185.125.21%由表4可知，在最优工艺参数条件下，紫苏叶中黄酮提取率的平均值为5.21%，高于其他工艺参数条件下的提取率。2.5紫苏叶黄酮提取物体外抗氧化活性检测结果2.5.1紫苏叶黄酮和VC对DPPH·的清除率（见表5）由表5可知，紫苏叶黄酮提取物对DPPH·清除率（RDPPH·）随着紫苏叶黄酮浓度的增加而增加，呈先急剧上升后逐渐平缓的趋势。紫苏叶黄酮的浓度从0.025 g/L提高至0.100 g/L时，RDPPH·从11.40%快速提升至74.16%；当浓度增加至0.2 g/L时，RDPPH·达85.84%，后续升高幅度较小。结果表明，紫苏叶黄酮在0.200 g/L可以达到较好清除DPPH·能力。并且紫苏黄酮提取物RDPPH·始终高于同等质量浓度下的VC，表现出较强的DPPH·清除效果，表明紫苏黄酮对DPPH·的清除能力强于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.T005表5紫苏叶黄酮和VC对DPPH·的清除率项目浓度/(g/L)0.0250.0500.1000.2000.400紫苏叶黄酮11.4056.2274.1685.8486.82VC2.8511.6324.4062.4378.04%2.5.2紫苏叶黄酮和VC对OH·的清除率（见表6）由表6可知，紫苏叶黄酮提取物对OH·清除率（ROH·）随紫苏叶黄酮浓度的增加而提高，呈持续升高的趋势。当紫苏叶黄酮浓度为0.400 g/L时，ROH·达到最大，为56.63%。研究表明，同等浓度下，紫苏叶黄酮的ROH·均低于VC，表明紫苏黄酮对OH·的清除能力弱于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.T006表6紫苏叶黄酮和VC对OH·的清除率项目浓度/(g/L)0.0250.0500.1000.2000.400紫苏叶黄酮7.8111.7718.4944.4156.63VC15.6221.5832.1251.8168.90%2.5.3紫苏叶黄酮和VC对·O2-的清除率（见表7）由表7可知，在0.025~0.400 g/L范围内，紫苏叶黄酮对·O2-清除率（R·o2-）随紫苏叶黄酮浓度的增加而提高，呈现出持续升高的趋势。当紫苏叶黄酮浓度为0.400 g/L时，R·o2-达到68.28%。研究表明，同等浓度下，紫苏叶黄酮对·O2-清除率均略低于VC，但整体差距不大，表明紫苏叶黄酮对·O2-的清除能力，与VC作用相近。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.014.T007表7紫苏黄酮和VC对·O2-的清除率项目浓度/(g/L)0.0250.0500.1000.2000.400紫苏叶黄酮32.3042.6546.3556.5868.28VC34.2043.6248.7960.9676.09%3讨论微波辅助提取工艺是利用不同物质吸收微波的能力不同，使微波可以选择性加热物质，从而使物质在细胞内产生高温高压并破坏细胞壁，有效促进物质快速溶出[20-21]。本研究中，影响紫苏叶黄酮提取率因素排序为：乙醇浓度提取时间微波功率，并且乙醇浓度对紫苏黄酮提取率具有极显著影响，与韩芳等[22]研究类似。可能是由于天然黄酮类物质常以苷类形式存在，易溶于甲醇、乙醇和水等极性较强的溶剂中，天然黄酮类物质的溶解性与其形成的苷类结构有关，根据相似相容原理，紫苏叶中黄酮类物质可能与乙醇溶剂的极性较为接近，因此较高浓度的乙醇溶剂有利于紫苏叶黄酮物质溶出。本研究结果显示，从紫苏叶中提取黄酮的最优工艺参数为：乙醇浓度80%、微波功率300 W、提取时间30 min。李晓雪等[23]以黄酮提取率为检测指标，利用响应面法优化从紫苏叶中提取黄酮的最佳提取工艺参数为30.16 min、微波功率269.49 W、液料比14.97 mL/g、乙醇体积分数80%，本试验研究结果相似。但在最优工艺参数下李晓雪等[23]得到的实际提取率为7.83%，比本研究优化后的提取率（5.21%）高。可能是因为黄酮类物质广泛存在于植物的根茎叶果等部位中，是植物的次生代谢产物[24]，黄酮类物质的种类和含量常因植物种类、种植环境和采摘时节等因素而异[25]。因此，不同研究中使用同种植物的相同部位，其黄酮提取率可能存在一定的差异。黄酮类物质是一种天然抗氧化剂，由于其化学结构中包含容易被自由基夺走的电子，从而能够有效防止自由基引发氧化反应[6]。本研究结果表明，紫苏叶黄酮浓度在0.025~0.400 g/L范围内，其对DPPH·、OH·和·O2-均呈现随黄酮浓度增加而清除率上升的趋势，即存在剂量依赖效应。应艳杰等[26]研究表明，随紫苏黄酮浓度增加，其对OH·和·O2-清除能力越强，抗氧化活性也增强，当黄酮浓度达到0.5 mL/mL时，清除率可以达90%以上。本研究以VC作为对照，发现紫苏黄酮提取物对DPPH·清除能力强于VC，而对OH·和·O2-的清除能力则弱于VC，与李美玲等[27]对茭白黄酮的抗氧化研究结果类似。可能是由于黄酮提取液中，含有未被鉴定的阻碍抗氧化过程的拮抗物质，对黄酮的自由基清除能力起抑制作用。4结论本研究表明，利用微波作为辅助，提取紫苏叶中的黄酮，影响紫苏黄酮提取率因素排序为：乙醇浓度提取时间微波功率。最优提取工艺参数为：乙醇浓度80%、微波功率300 W和提取时间30 min，此工艺条件下的紫苏叶黄酮提取率为5.21%。体外抗氧化试验显示，紫苏黄酮提取物对DPPH·、OH·和·O2-均具有较好的清除效果，表明紫苏叶黄酮具有较好的抗氧化能力，是一种优质的天然抗氧化物质。