牛鼻支原体（Mycoplasma bovirhinis）属于柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属，是导致牛呼吸系统疾病综合征和乳腺炎的病原之一[1]。1965年，Harbourne等[2]从英格兰患有乳房炎的奶牛上首次分离到该病原。牛鼻支原体是一种致病性较弱的继发性感染原，通常可与其他病原体混合感染，在机体抵抗力减弱的情况下，发挥致病作用引起继发性感染使宿主病情加重[3]。牛鼻支原体的分离来源并不唯一，通常在患有肺炎犊牛的鼻拭子、肺脏组织中有较高的分离率，在健康犊牛的鼻腔中分离率则较低。从病牛的肾脏、奶样、耳道中也有分离出牛鼻支原体的相关报道[4-7]。目前，国内对牛鼻支原体的研究甚少，仅有对牛鼻支原体GS01株全基因组序列分析的报道[8]。本研究使用支原体属通用引物以及多种支原体特异引物对采集到的病牛鼻拭子和病死牛肺脏组织进行检测，并使用支原体培养基进行分离培养，旨在确定临床病例中支原体的感染分布，为牛养殖生产中支原体相关疾病的防控提供资料，为相关支原体的深入研究提供参考菌株。1材料与方法1.1病料采集新疆南疆某规模化奶牛场发病犊牛鼻拭子30份，病死犊牛病变肺脏组织1份。发病犊牛出现咳嗽、气喘、黏性鼻液等临床症状；病死犊牛剖检见：肺脏实变、大小不一的结节状病灶。1.2试剂和仪器支原体培养基PPLO Broth、PPLO Agar均购自BD公司；马血清购自HyClone公司；2×PCR Mix、基因组DNA提取试剂盒、pGM-simple-T fast载体、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR扩增反应仪购自BIO-RAD公司；超净工作台购自上海博讯实业有限公司；电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。1.3样本处理鼻拭子样本：使用无菌镊子将鼻拭子中的棉签挤干。肺脏使用无菌外科剪从肺脏病健交界处剪开一小口，从深部取黄豆样大小组织块于1.5 mL离心管中加1 mL生理盐水充分研磨。1.4病原分离将处理过的鼻拭子和肺组织研磨液1 500 r/min离心3 min，取500 μL上清液至含有酚红指示剂的支原体液体培养基中，放入37 ℃恒温培养箱中培养，待培养基颜色变黄后，使用0.45 μm滤膜过滤传入新的液体培养基，待液体培养基颜色变黄且澄清后，取200 μL培养液接入支原体固体培养基，37 ℃、5%CO2培养箱中培养48~72 h，使用光学显微镜镜检，挑取“煎蛋状”单菌落进行纯培养，经3次纯化后保菌。1.5PCR鉴定支原体属16S rRNA通用引物、牛支原体特异引物、牛鼻支原体特异引物、殊异支原体特异引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.013.T001表1引物信息Tab.1Primers information引物靶基因引物序列（5'→3'）退火温度/℃产物大小/bp支原体属通用引物16S rRNAF：AGAGTTTGATCCTGGGCTCAGGAR：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC58.01 021牛支原体uvrcF：TTACGCAAGAGAATGCTTCAR：TAGGAAAGCACCCTATTGAT52.01 626牛鼻支原体16S rRNAF：GCTGATAGAGAGGTCTATCGR：ATTACTCGGGCAGTCTCC60.0315殊异支原体16S rRNAF：TTAAAGCTCCACCAAAAAR：GTATCTAAAGCGGACTAAA53.64331.5.1DNA提取取鼻拭子菌液、纯培养液，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，取肺脏组织研磨沉淀，使用组织基因组提取试剂盒提取基因组DNA。1.5.2PCR扩增使用表1中的引物分别扩增对应的目的基因片段。PCR反应体系25 μL：2×PCR mix12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL。支原体通用引物反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸5 min。牛支原体特异引物反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸5 min。牛鼻支原体特异引物反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸5 min。殊异支原体特异引物反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，53.6 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸5 min。1.5.3克隆和测序使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR阳性产物，经连接、转化后提取质粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。1.5.4序列分析登陆NCBI网站对测序完成的序列进行BLAST比对，并下载相似度较高的序列使用DNA star软件进行同源性比较分析，使用MEGA 6.0软件构建遗传进化树。2结果与分析2.1病原分离纯化结果（见图1）由图1可知，将处理过的病料接种于液体培养基，培养48~72 h后，取颜色变黄的培养液使用0.45 μm滤膜传代培养，直至液体培养基颜色变黄且不浑浊，然后取200 μL培养液接种至固体培养基上，培养3 d后在光学显微镜下镜检可观察到“煎蛋状”菌落。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.013.F001图1分离株菌落形态（40×）Fig.1Colony morphology of isolates (40×)2.2分离株支原体属引物PCR扩增结果（见图2、图3）由图2、图3可知，提取分离纯化后菌落基因组DNA，以支原体属通用引物和牛鼻支原体特异引物分别扩增出1 021 bp和315 bp的目的片段，与预期片段大小相符。以牛支原体、殊异支原体特异引物扩增未能扩增出任何条带。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.013.F002图2分离株支原体属引物PCR扩增结果Fig.2PCR amplification results of Mycoplasma isolates with universal primers注 ： M为DL2000 DNA Marker；1为分离株；2为阴性对照。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.013.F003图3分离株牛鼻支原体特异引物PCR扩增结果Fig.3PCR amplification results of Mycoplasma bovirhinis isolates with specific primers注 ： M为DL2000 DNA Marker；1为分离株；2为阴性对照2.3序列分析2.3.1分离株同源性分析（见图4）将分离株的16S rRNA基因序列与GenBank已公布的7株支原体16S rRNA基因序列进行同源性对比。由图4可知，分离株与牛鼻支原体甘肃株GS01（NZCP024049.1）的同源性为98.2%，与牛鼻支原体日本株HAZ141-2（NZAP018135.1）的同源性为97.9%；与牛支原体PG45株（NZCP007589.1）、HB0801-P115株（NC014760.1）的同源性分别为85.5%和85.8%；与犬支原体PG14株（NR028813.1）、LV株（NZCP011368.1）的同源性分别为94.9%和95.2%；与殊异支原体ATCC 27140株（NZCP007229.1）的同源性为80.6%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.013.F004图4基于16S rRNA核苷酸序列的同源性比较Fig.4Homology comparison based on 16S rRNA nucleotide sequence2.3.2分离株系统进化树分析（见图5）由图5可知，本研究分离株与牛鼻支原体GS01株（NZCP024049.1）、牛鼻支原体HAZ141-2株（NZAP018135.1）在同一分支，亲缘关系最近，与犬支原体PG14株（NR028813.1）、LV株（NZCP011368.1）亲缘关系较近，与牛支原体PG45株（NZCP007589.1）、HB0801-P115株（NC014760.1）的亲缘关系较远，与殊异支原体ATCC27140株（NZCP007229.1）亲缘关系最远。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.013.F005图5基于支原体16S rRNA核苷酸序列构建的系统遗传进化树Fig.5Phylogenetic tree based on Mycoplasma 16S rRNA nucleotide sequence3讨论1981年，Friis[9]对牛鼻支原体的致病性进行研究，尝试通过人工感染牛鼻支原体导致犊牛肺炎，但并未成功。2017年，Hata等[10]首次公布牛鼻支原体日本株的全基因组序列。2018年，我国学者完成牛鼻支原体甘肃株的全基因组测序，并对其遗传进化关系和假定的毒力因子进行分析，发现与牛支原体相比，牛鼻支原体甘肃株GS01缺少多个毒力基因，由此推测相关毒力基因的缺失造成其致病性低于牛支原体[8]。2020年，Catania等[11]对意大利新进口的公牛进行支原体感染情况的监测，发现牛鼻支原体的感染率与季节有一定关系，夏季的感染率高于冬季，但环境因素的改变对牛支原体的感染率无显著的影响。本研究中，犊牛发病集中在8月份，可能与季节转换造成的应激相关。支原体属的16S rRNA核苷酸序列具有较高的种间差异性和种内保守性，可用于支原体的菌种鉴定[12]。对牛呼吸系统具有较强致病性作用的支原体有牛支原体、殊异支原体等。本研究对发病犊牛的鼻拭子和病死牛的肺脏组织进行支原体检测、分离，结果显示病牛牛鼻支原体鼻拭子阳性率为70%，并成功从病死牛肺脏组织中分离到1株牛鼻支原体，未检测分离到其他支原体。同源性分析显示，分离株的16S rRNA核苷酸序列与牛鼻支原体甘肃株GS01和牛鼻支原体日本株HAZ141-2的同源性分别为98.4%和98.2%。16S rRNA核苷酸序列构建的遗传进化树显示分离株与牛鼻支原体甘肃株GS01和牛鼻支原体日本株HAZ141-2的遗传关系最近，从分子水平上证实该分离株为牛鼻支原体。本研究未对除支原体以外的其他病原进行检测，所以不能断定该病原造成采样牛场犊牛的发病及死亡。尽管牛鼻支原体的致病性与牛支原体相比较弱，但对该病原进行流行病学监测，病原分离仍有重要意义。4结论本研从新疆南疆某规模化牛场病死牛肺脏组织中分离到1株支原体，确定为牛鼻支原体，病牛鼻拭子牛鼻支原体检测阳性率为70%。本研究可为新疆地区牛场牛鼻支原体的感染情况提供参考。