沙门氏菌属于肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，菌体呈椭圆形，含有2 600多种血清型[1]。国际兽疫局将沙门氏菌定为B类传染病病源[2]。在养殖业中，沙门氏菌多存在于饲料中，动物食用被沙门氏菌污染的饲料，能够造成禽畜腹泻、呕吐、伤寒等，导致动物营养不良，甚至死亡。有研究人员从进口饲料中分离得到148株沙门氏菌[3]。沙门氏菌能够通过食源性途径传染给人类，引起一系列胃肠道疾病[4]。据我国2015年食源性监测报告显示，沙门氏菌是食源性疾病暴发的主要致病因子之一[5]。2018年6月—10月河北省市售猪肉馅及冷鲜鸡中沙门氏菌污染情况调查与分析结果显示，沙门氏菌阳性检出率为63%，检出率较高，具有较大的食品安全隐患[6]。苏华等[7]从48份饲料及饲料添加剂中分离得到5株沙门氏菌，检出率较高。目前，沙门氏菌病原体的临床检测大多是借助实验室诊断进行分析检测，包括沙门氏菌分离与鉴定[8]、酶联免疫吸附试验[9]、聚合酶链反应[10]、实时荧光定量RT-PCR[11]和环介导等温核酸扩增技术[12]等。但上述检测方法存在诊断时间较长、操作繁杂等缺点，仅适用于实验室准确检测，限制了沙门氏菌的现场和临床诊断。免疫层析检测技术（ICA）是一种将色谱法和免疫学反应相结合的快速检测技术[13]。胶体金免疫层析技术是比较常用的免疫层析技术，传统胶体金免疫层析技术常用的金颗粒大多都是采用Frens法[14]制备，但这种方法制备的胶体金稳定性差，制备的试纸条灵敏度低。因此，本试验使用改良后的Tris辅助法制备稳定性更强的胶体金，从而制备灵敏度高、稳定性强的沙门氏菌检测试纸条，旨在为沙门氏菌的现场和临床检测提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1主要试剂沙门氏菌单克隆抗体Ab1和Ab2，均购自常州中美歆新生物科技有限公司；羊抗鼠IgG购自上海生工生物工程有限公司。牛血清白蛋白、柠檬酸钠、四氯金酸均购自美国Sigma公司，硝酸纤维素膜购自美国Milipore公司。样品垫、结合垫、吸水纸、PVC底板，均购自上海金标生物科技有限公司。沙门氏菌及其他菌株由广西大学动物科学技术学院收集和保存。1.1.2主要仪器HR/T16MM微量高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司），ZQ2002微电脑自动斩切机、CTS300XYZ数控裁条机、HM3035三维化膜喷金仪（上海金标生物科技有限公司），F200S赛默飞透射电子显微镜（美国赛默飞公司），UV-2700紫外可见光分光光度计（日本岛津仪器有限公司）。1.2测定指标及方法1.2.1胶体金的制备采用Tris辅助法制备胶体金，观察其颜色等外观特征，利用紫外分光光度计扫描紫外吸收图谱，采用透射电镜测定其均一性和颗粒大小。Tris辅助法制备胶体金步骤为：量取140 mL超纯水于250 mL的三颈烧瓶中，置于磁力加热搅拌器上的油浴容器中，三颈烧瓶上方连接冷凝管，设定磁力加热搅拌器，温度为137 ℃，转速为450 r/min；当温度到达100 ℃，将10 mL 1%柠檬酸钠溶液加入烧瓶中，继续加热40 min，当溶液温度稳定于137 ℃时，从侧边的瓶口中注入1 mL 1%的氯金酸溶液，反应60 s；将5 mL 0.1 mol/L Tris-base溶液注入溶液的漩涡中心处，继续反应30 min，调节加热搅拌器温度为100 ℃，待溶液温度降至100 ℃，一次性将1 mL 1%氯金酸溶液注至三颈烧瓶中的漩涡中心处，继续反应30 min。重复上一步骤，反应结束停止加热，在搅拌状态下自然冷却至室温转移至蓝盖瓶中，4 ℃避光保存。1.2.2胶体金层析免疫试纸条组装1.2.2.1NC膜的准备将抗沙门氏菌单抗Ab1和羊抗鼠IgG使用10 mmol/L PB溶液稀释为1 g/L，使用三维划膜仪将抗沙门氏菌单抗Ab1和羊抗鼠IgG分别划线于NC膜中心位置，形成检测线（T线）和质控线（C线）。将划好线的NC膜放入鼓风干燥箱中，37 ℃干燥2.5 h，将烘干好的NC膜密封，干燥，保存。1.2.2.2试纸条的组装将样品垫和吸水纸使用数控裁条机裁成200 mm × 20 mm，将NC膜贴于PVC底板上，把结合垫贴于NC膜靠近T线一端，两者重合约1 mm，将样品垫紧贴着结合垫粘在PVC底板上，与结合垫重合约2 mm。将吸水纸与NC膜重合2 mm贴于靠近C线的一端。切割为宽3 mm、长6.5 cm的试纸条，置于含有干燥剂的自封袋中。1.2.3胶体金最适标记pH值取6只1.5 mL透明玻璃瓶，每管加入1 mL胶体金溶液，分别加入0、5、15、25、35、45 μL K2CO3（0.1 mol/L）调整pH值，每管加入2 μg沙门氏菌单抗Ab2，混匀，静置30 min，每管加入100 μL 10% BSA混匀封闭1 h，4 ℃、8 000 r/min离心15 min，200 μL复溶液（10 mmol/L pH值8.5 tris-HCl+10%蔗糖+1% BSA+0.5%吐温-20）重悬，使用试纸条测试样品，确定最适标记pH值。1.2.4胶体金最佳蛋白标记量取4只1.5 mL透明玻璃瓶，每管加入1 mL胶体金溶液，加入25 μL 0.1 mol/L K2CO3混匀2 min，再加入0.5、1.0、2.0、4.0 μL抗沙门氏菌单克隆抗体，混匀静置30 min，向每管加入100 µL 10% BSA混匀封闭1 h，4 ℃、8 000 r/min离心15 min，200 µL复溶液重悬，使用试纸条测试，确定最佳蛋白标记量。1.2.5胶体金标记抗体制备将1 mL胶体金溶液加入1.5 mL透明玻璃瓶中，加入25 µL 0.1 mol/L K2CO3混匀2 min，再加入1 µL抗沙门氏菌单克隆抗体，混匀，静置30 min，向每管加入100 µL 10% BSA混匀静置封闭1 h，4 ℃、8 000 r/min离心15 min，200 µL复溶液重悬，均匀滴涂在结合垫上，37 ℃烘干2.5 h，密封袋内4 ℃保存。1.2.6胶体金免疫层析试纸条性能检测1.2.6.1灵敏度试验将测序为肠炎沙门氏菌的阳性样品扩菌，使用PBS稀释至104~108 CFU/mL，取各浓度菌液60 µL滴加至试纸条上面，15 min后观察结果确定灵敏度。1.2.6.2特异性试验将测序为肠炎沙门氏菌的阳性样品、大肠杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、锡那罗弧菌各取60 μL，滴加至试纸条上面，15 min后观察结果，确定试纸条的特异性。1.2.6.3重复性试验从制备的试纸条中随机抽取9根试纸条，对高（108 CFU/mL）、低浓度（107 CFU/mL）的阳性样品进行检测，同时做阴性对照。1.2.6.4稳定性试验将制备好的试纸条避光存放在4 ℃环境中，每隔30 d随机抽取两条试纸条，检测阳性样品和阴性对照，观察和比对检测结果，确定试纸条稳定性。1.2.6.5加标回收检验将羊粪便样品使用PBS处理加入浓度分别为5×107、5×106、5×105 CFU/mL的沙门氏菌进行检测，并做阴性对照，每个浓度做3个平行试验，据检测结果计算回收率，根据回收率评价试纸条实际检测效果。2结果与分析2.1胶体金的制备与表征结果（见图1）由图1（a）可知，采用Tris辅助法制备的胶体金颜色为酒红色，清澈无沉淀，溶液比较稳定。由图1（b）、1（c）可知，胶体金透射电子显微镜图的纳米颗粒大小均匀，接近圆球状，平均粒径约25 nm。由图1（d）可知，胶体金颗粒具有一个519 nm左右的吸收峰，峰宽比较窄。因此，研究制得的胶体金颗粒均匀，符合显微镜拍摄结果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.022.F001图1胶体金的制备与表征结果2.2胶体金标记最适pH值的优化结果（见图2）由图2可知，当1 mL胶体金加25 μL 0.1 mmol/L的K2CO3时阳性样品的T线颜色最红，膜面比较干净，此时胶体金溶液的pH值为8.5，后续试验均基于此pH值进行。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.022.F002图2胶体金试纸条最适pH值优化结果注：从左到右依次为25 µL 0.1 mmol/L K2CO3对照组、添加0、5、15、25、35、45 µL 0.1 mmol/L K2CO3。2.3胶体金最适蛋白量优化结果（见图3）胶体金连接抗体的量能够很大程度上影响试纸条的灵敏度，但偶联的抗体多会导致抗体的浪费，还会产生拖带现象，造成不良影响。由图3可知，加入1 µL抗体时，试纸条的T线最清晰，膜面比较干净，随着抗体的增加试纸条T线颜色也并未加深。因此该试纸条的胶体金最佳蛋白标记量为1 µL 1.9 g/L的抗沙门氏菌单克隆抗体Ab2，在此基础上，实际最适蛋白量需要增加20%，也就是每1 mL的胶体金添加1.2 µL 1.9 g/L的抗沙门氏菌单克隆抗体Ab2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.022.F003图3胶体金最适蛋白量优化结果注：从左到右分别为抗体量1 µL的空白对照、0.5、1.0、2.0、4.0 µL抗体。2.4胶体金免疫层析试纸条的性能检测结果2.4.1试纸条灵敏度结果（见图4）由图4可知，当沙门氏菌为108、107 CFU/mL时能够清晰可见T线，当稀释至106 CFU/mL时仍可以见到检测线，当稀释至105 CFU/mL的时候，已经观察不到检测线。因此该试纸条的检测限为106 CFU/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.022.F004图4试纸条灵敏度结果注：从左到右样品依次为108、107、106、105、104 CFU/mL的沙门氏菌和空白对照。2.4.2试纸条特异性考察结果（见图5）由图5可知，仅有样品为肠炎沙门氏菌时，T线处有明显红色条带，其他菌液的结果与阴性对照一样，表明该试纸条除与肠炎沙门氏菌发生反应外，与其他菌均没有交叉反应，证明该试纸条特异性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.022.F005图5试纸条特异性考察结果2.4.3试纸条重复性考察结果（见图6）由图6可知，试纸条检测结果相同，说明该试纸条重复性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.022.F006图6试纸条重复性考察结果2.4.4试纸条在4 ℃的稳定性检测结果（见图7）由图7可知，试纸条在4 ℃保存4个月测试结果均一致，T线颜色保持良好，无假阳性或假阴性情况发生，表明该试纸条具有良好的稳定性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.022.F007图7试纸条在4 ℃条件下稳定性检测结果2.4.5沙门氏菌加标检测结果（见图8、表1）由图8和表1可知，加标样品浓度只有大于检测限1×106 CFU/mL可以检出，阴性对照和低于检测限浓度样品均未检出，回收率为100%，表明该试纸条对实际样品的检测准确性好，具有能够检测实际样品的能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.022.F008图8沙门氏菌加标检测结果注：从左到右依次为浓度5×107、5×106、5×105 CFU/mL的沙门氏菌和阴性对照结果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.022.T001表1沙门氏菌加标回收检测结果项目加标浓度/(CFU/mL)结果粪便5×107＋＋＋5×106±±±5×105－－－PBS0－－－注：“+”为阳性；“-”为阴性；“±”为弱阳性。3讨论目前对沙门氏菌的诊断主要依靠实验室诊断方法，但是这些方法都需要专业人员和昂贵的仪器，操作也比较烦琐，无法在层养殖场开展应用。胶体金免疫层析技术具有灵敏、快速、无须特殊仪器、操作简单等优点，随着胶体金免疫层析技术的发展，胶体金免疫层析试纸条也逐渐在各个领域被广泛应用。饲料中沙门氏菌主要检测方法包括传统检测法、ELISA检测法、PCR检测法等技术[15]。彭喆等[16]基于普通法制得的胶体金制备的沙门氏菌试纸条的灵敏度达到1.07×107 CFU/mL。本试验利用Tris辅助法制备的胶体金颗粒均匀、形状均一，能够更好地发挥胶体金试纸条的优势，相比普通法制备的胶体金性能更加优越，制备的试纸条灵敏度更高，最低检测线达1×106 CFU/mL，并且特异性和重复性良好。4结论本试验基于Tris辅助法制得的胶体金建立了一种能够快速检测沙门氏菌的免疫层析试纸条，能够实现对沙门氏菌的现场检测。