近年来，抗生素带来的细菌耐药性、药物残留等问题日益严峻，严重威胁食品安全和人类健康[1]。我国农业农村部第194号公告要求，2020年全面实施“饲料禁抗”政策[2]。因此，寻找无药物残留、无耐药性的绿色饲料添加剂成为研究热点。地衣芽孢杆菌作为一种非致病类益生菌，在生长过程中能够分泌多种酶、多糖和小分子活性物质[3]，提高动物的生产性能，增强机体免疫力，是极具应用潜力的菌种之一。益生菌能够产生抑菌作用的一部分原因是细菌在新陈代谢中产生具有拮抗作用的多肽类物质，一般为抗菌肽[4]。抗菌肽作为一种新型的小分子碱性多肽，具有高效性、抗菌谱广、溶解性好、耐热性强、pH值适应范围广的特点[5-7]。Abdallah等[8]、Ambrico等[9]发现，抗菌肽达到一定的浓度对病原菌具有很好的拮抗效果。动物体自身分泌的抗菌肽产量少，不能达到抑制病菌的浓度，因此微生物发酵生产抗菌肽成为一种有效的途径。在发酵过程中，培养基营养成分、发酵条件和代谢调节机制均是影响地衣芽孢杆菌产生次生代谢产物的主要因素，其中温度、转速和接种量在工业化生产中具有重要作用[10]。本研究前期从污水处理厂附近土壤中分离筛选出一株抗菌活性良好，且能够稳定遗传的菌株CGMCC 24209，对该菌株进行分类鉴定，优化其发酵条件，为CGMCC 24209的工业化生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌种实验室自行分离筛选的菌株CGMCC 24209由生工生物工程（上海）股份有限公司进行致病性风险评估，对人体不具有致病性。菌株CGMCC 24209在实验室菌种库和中国科学院微生物研究所保存；金黄色葡萄球菌（CICC10473）由中国微生物工业研究所提供。1.1.2主要试剂蛋白胨、酵母膏、氯化钠、葡萄糖、黄豆饼粉、碳酸钙，均购自北京索莱宝科技有限公司，七水合硫酸镁购自南京化学试剂股份有限公司，Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。1.1.3培养基LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g、氯化钠10 g/L，固体培养基加15 g/L的琼脂粉，pH值7.2，121 ℃灭菌30 min。发酵培养基：蛋白胨14.29 g/L、葡萄糖42 g/L、黄豆饼粉6.49 g/L、碳酸钙2.0 g/L、七水合硫酸镁1.0 g/L，pH值7.0，121 ℃灭菌30 min。1.2形态结构观察及生理生化试验从前期试验土壤中筛选9株产抗菌肽的菌株，取对病原细菌抑制效果最佳的菌株CGMCC 24209，接种于LB固体培养基上观察菌落形态，采用Gram染色法在显微镜下观察菌体形态，采用《伯杰氏细菌鉴定手册》[11]和《常见细菌系统鉴定手册》[12]进行生理生化鉴定。1.3分子生物学鉴定使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株A3-1基因组DNA，以菌株A3-1基因组DNA作为模板，采用细菌通用引物16S rDNA扩增。正向引物27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR扩增反应体系为25 μL：基因组10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，Taq酶（5 U/μL） 0.5 μL，MgSO4 (50 mmol/L) 5 μL，27F 1 μL，1 429R 1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应[13-14]。取5 μL扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测送至上海生工测序。获得菌株16S rDNA基因序列，在NCBI数据库中进行BLAST搜索，选取与该序列同源性较高的核酸序列，利用ClastalX(1.83)软件进行多重序列比对，使用MEGA 5.0邻接法构建菌株CGMCC 24209系统发育树[15]。1.4测定指标及方法1.4.1发酵条件优化1.4.1.1种子液制备将甘油保存的菌种室温冷却，按1%接种量接入装有150 mL LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振荡培养16 h。1.4.1.2发酵温度试验设置发酵温度分别为28、30、32、34和36 ℃。将种龄为16 h的种子液以3％接种量接入初始pH值7.0、装液量为30％发酵培养基中，200 r/min摇床发酵培养48 h，检测发酵液的杀菌效价，确定最佳发酵温度[16]。1.4.1.3发酵培养基初始pH值试验设置初始pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。将种龄为16 h的种子液以3％接种量接入装液量为30%发酵培养基中，36 ℃、200 r/min发酵48 h，检测发酵液的杀菌效价，确定最佳初始pH值[17]。1.4.1.4接种量试验设置接种量分别为1%、3%、5%、7%、10%。将种龄为16 h的种子液分别按相应种量接入初始pH值7.0、装液量为30%发酵培养基中，36 ℃、200 r/min摇床发酵48 h，检测发酵液的杀菌效价，确定最佳接种量[18]。1.4.1.5摇床转速试验设置摇床转速分别为160、180、200、220和240 r/min。将种龄为16 h的种子液以3％接种量接入初始pH值7.0、装液量为30％的酵培养基中，36 ℃发酵48 h，检测发酵液的杀菌效价，确定摇床最佳发酵转速。1.4.1.6发酵时间试验设置发酵时间为0、6、24、30、48、55 h。将种龄为16 h种子液以3％接种量接入初始pH值7.0、装液量为30％发酵培养基中，36 ℃、200 r/min摇床发酵，检测发酵液的杀菌效价，确定最佳发酵时间。1.4.2抗菌活性测定效价平板制备：以金黄色葡萄球菌（CICC10473）为指示菌制备效价平板。在无菌环境中，取一环金黄色葡萄球菌于装有150 mL LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃恒温振荡培养16 h。取200 μL稀释的指示菌液（106 CFU/mL）均匀涂布于LB固体培养基平板上。采用标准琼脂孔穴扩散法[19]测定发酵液的杀菌效价。使用2.7 mm的打孔器（奶管）在效价平板上均匀打孔，每孔分别加入5 μL发酵上清液，每个样品做3个平行，4 ℃冰箱中预扩散2 h，37 ℃的生化培养箱中培养12~15 h，测量抑菌圈直径，计算杀菌效价。杀菌效价(IU/mL)=2X×1 000×稀释倍数(1)式中：X=(抑菌圈直径-2.7)/2.1[20]；抑菌圈直径为3个抑菌圈直径的平均值；2.7为孔穴直径；2.1为抗菌肽浓度与抑菌圈直径的比值常数。2结果与分析2.1菌株CGMCC 24209菌落形态、革兰氏染色及生理生化鉴定结果（见图1、图2、表1）由图1、图2可知，菌落白色不透明，表面干燥，边缘不整齐，呈锯齿状。经革兰氏染色后显微镜观察菌落为紫色，着色均匀，无荚膜，初期为短杆状，培养一定时间后产生大量芽孢。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.F001图1菌株CGMCC 24209菌落形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.F002图2菌株CGMCC 24209革兰氏染色结果（1 000×）由表1可知，菌株CGMCC 24209硝酸盐还原、接触酶反应、吲哚反应、V-P反应、糖发酵（葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖）产酸反应、水解淀粉、甘露醇产酸反应、明胶水解反应均为阳性；在50、70 g/L NaCl条件下菌株生长状况良好，在100 g/L NaCl条件下生长欠佳，根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，可初步鉴定该菌为革兰氏阳性芽孢杆菌属。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.T001表1菌株CGMCC 24209的生理生化试验结果项目反应结果项目反应结果项目反应结果接触酶+水解淀粉+Gram染色+V-P反应+硝酸盐还原+厌氧生长+葡萄糖+甘露醇+50 g/L NaCl+L-阿拉伯糖+吲哚反应+70 g/L NaCl+D-木糖+明胶水解+100 g/L NaCl-注：“+”表示反应结果为阳性，“-”表示反应结果为阴性。2.2菌株CGMCC 24209的16S rDNA扩增、测序及系统发育树分析（见图3、图4）由图3可知，经测序公司测序分析后，获得长度为1 488 bp的序列片段；将该序列在NCBI数据库中进行BLAST搜索，发现该序列与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）同源性极高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.F003图3PCR扩增产物电泳图注：Marker： DL3 000bp DNA marker。由图4可知，采用邻接法构建基于16S rDNA序列的系统发育树，结合其形态学特征，确定菌株CGMCC 24209为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.F004图4基于16S rDNA序列的系统发育树2.3菌株CGMCC 24209的最适发酵条件2.3.1温度对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响（见表2、图5）由表2可知，温度对菌株CGMCC 24209的杀菌效价影响显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.T002表2温度对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响项目温度/℃2830323436OD600 nm值10.8513.8013.2112.328.16抑菌圈直径/mm12.5417.8116.1416.1812.70杀菌效价/(IU/mL)25 741b146 525a84 448ab85 627ab27 096b注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。由图5可知，30 ℃时的发酵液对金黄色葡萄球菌的杀菌效价最高。因此，确定30 ℃为菌株CGMCC 24209的最适发酵温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.F005图5温度对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响2.3.2初始pH值对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响（见表3、图6）摇瓶发酵过程中pH值不易控制，因此只考虑初始pH值对产抗菌肽的影响。由表3可知，初始pH值对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.T003表3初始pH值对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响项目初始pH值6.06.57.07.58.0OD600 nm值7.424.426.727.567.68抑菌圈直径/mm12.20512.23513.49512.4911.39杀菌效价/(IU/mL)23 039ab23 264ab35 273a25 316ab17 603b由图6可知，初始pH值为7.0时发酵液对金黄色葡萄球菌的杀菌效价最高，能够达到35 273 IU/mL。因此，可以确定初始pH值为7.0是菌株CGMCC 24209的最适发酵培养基初始pH值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.F006图6初始pH值对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响2.3.3接种量对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响（见表4、图7）由表4可知，接种量对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响显著（P0.05）。由图7可知，接种量为7%时发酵液对金黄色葡萄球菌的杀菌效价最高。因此，确定接种量7%为菌株CGMCC 24209的最适接种量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.T004表4接种量对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响项目接种量/%13579OD600 nm值7.657.177.387.327.74抑菌圈直径/mm13.49512.7712.78513.6513.51杀菌效价/(IU/mL)35 273a27 765b28 325b37 125a35 506a10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.F007图7接种量对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响2.3.4转速对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响（见表5、图8）由表5可知，转速对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响显著（P0.05）。由图8可知，当转速达到220 r/min 时，CGMCC 24209抑菌圈直径和杀菌效价最高。因此，220 r/min 为菌株CGMCC 24209的最佳转速。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.T005表5转速对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响项目转速/(r/min)160180200220240OD 600 nm值6.226.027.0824.0434.6抑菌圈直径/mm9.81510.73511.9914.4914.29杀菌效价/(IU/mL)104 69b14 182ab21 466ab48 976a45 855a10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.F008图8转速对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响2.3.5发酵时间对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响（见表6、图9）由表6可知，发酵时间对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.T006表6发酵时间对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响项目发酵时间/h01224364860OD600 nm值2.3286.431210.4812.3513.37抑菌圈直径/mm06.6111.39513.2214.15513.95杀菌效价/(IU/mL)0b3 630b17 603ab32 000ab43 713a41 070a由图9可知，当发酵时间达到48 h 时，菌株CGMCC 24209抑菌圈直径和杀菌效价达到顶峰，杀菌效价能达到43 713 IU/mL。因此，选择最适发酵时间为48 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.013.F009图9发酵时间对菌株CGMCC 24209杀菌效价的影响2.3.6优化后的杀菌效价按照优化后的发酵条件进行培养，48 h后取样，测得OD600 nm值为13.66；抑菌圈直径为18.05 mm，通过计算得出杀菌效价为158 573 IU/mL。3结论经过形态特征观察、生理生化试验以及16S rDNA测序分析鉴定，确定菌株CGMCC 24209为地衣芽孢杆菌。通过单因素试验对其发酵时间、温度、接种量、转速、初始pH值等条件进行优化，菌株CGMCC 24209最适发酵条件为：初始pH值7.0、装液量150 mL/500 mL、以7%的接种量于30 ℃、220 r/min摇床培养48 h。