高粱是禾本科一年生植物，营养价值高，且茎秆中富含糖分，是饲料行业生产中一种重要的原料作物[1]。高粱生长速度快（鲜草产量高达225~300 t/hm2），抗旱性强，适口性好，可以成为畜禽的饲料原料之一[2-3]。但高粱在夏季生长旺盛，鲜草产量过剩，而南方又潮湿多雨，鲜草不易保存。利用青贮技术将全株高粱制成青贮饲料，能够最大限度地保留其营养价值，延长储存时间，有效解决南方饲草供应季节性不均衡问题。研究表明，青贮高粱的粗蛋白含量、干物质瘤胃降解率、pH值等指标均与青贮玉米相当或更优[4-5]。在青贮底物中适量添加乳酸菌制剂，可有效加速青贮形成，提高青贮品质和营养价值[6-7]。目前，市场上青贮乳酸菌添加剂主要有2类，一类是同型发酵乳酸菌，代表菌种为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；另一类是异型发酵乳酸菌，代表菌种为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）。同型发酵乳酸菌的优点是发酵速度较快，pH值迅速降低以抑制有害菌生长，减少营养物质损耗，保存青饲料的营养成分[8]；而异型发酵乳酸菌则对维持青贮后饲料的有氧稳定性和营养价值具有促进作用[9]。目前，关于不同微生物添加剂在青贮高粱中的添加效果的研究较多，但多数研究仅比较了同型或异型单一菌种的影响，对同型+异型乳酸菌混合添加效果的研究相对较少。因此，本研究以全株高粱为研究对象，从营养成分、抗营养因子和瘤胃降解率等方面进行考察，旨在比较不同种类的青贮微生物添加剂及其复合添加剂（植物乳杆菌、布氏乳杆菌和植物乳杆菌+布氏乳杆菌）对青贮高粱的影响，以期为青贮高粱微生物添加剂的合理选择提供参考。1材料与方法1.1试验材料高粱购自君益农业合作社，为蜡熟初期收割的全株高粱。试验所用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏号分别为CICC 6026和CICC 20293。采用常规方法对各安瓿管中冻干菌种进行活化和培养[10]，制成各独立菌液，按1∶1等体积将两种菌液混合后低温保存。聚乙烯单向呼吸阀厌氧袋（规格600 mm×500 mm）购自实验室附近商铺。氨溶液、二甲基甲酰胺、单宁酸、氢氧化钠、氯化钠和植酸钠等（分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司。GJ-1000实验设备包括粉碎机（南京新维克多电器设备有限公司）、5425R微型冷冻离心机（信钰仪器有限公司）、HD-2500涡旋式振荡仪（鑫贝西科学仪器有限公司）、TJ270-30A分光光度计（天津诺雷信达科技有限公司）、FA2204N高精度电子天平（北京能克工程有限公司）、LHCQ-533A纤维分析仪（沧州欧海试验仪器有限公司）。1.2试验设计将高粱原料日光下晾晒至含水量约为70%~80%，使用粉碎机切短至3~5 cm，混匀，青贮前高粱原料营养物质成分及含量见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.019.T001表1青贮前高粱原料营养成分及含量项目数值干物质/%FW26.83±0.03粗蛋白/%DM6.82±0.11中性洗涤纤维/%DM39.65±0.87酸性洗涤纤维/%DM29.86±0.59可溶性碳水化合物/%DM10.39±0.12乳酸菌/lgCFU/g FW4.19±0.39霉菌/lgCFU/g FW5.95±0.08酵母菌/lgCFU/g FW6.12±0.05pH值5.71±0.02本试验共设计4个处理组：对照组（高粱中添加蒸馏水10 mL/kg）、植物乳杆菌组（高粱中添加植物乳杆菌液10 mL/kg）、布氏乳杆菌组（高粱中添加布氏乳杆菌液10 mL/kg）、复合菌组（高粱中添加植物乳杆菌+布氏乳杆菌混合菌液10 mL/kg），各试验组高粱中微生物含量为5×105 CFU/g。每组设置3个重复，共计12袋。将制备好的菌剂均匀地喷洒至切短后的高粱原料表面，充分混匀，装入厌氧袋，压实，密封，于室温（25~30 ℃）环境避光青贮70 d取样，随后测定青贮高粱营养成分、抗营养因子及消化率。1.3测定指标及方法1.3.1营养成分在青贮70 d开袋取样，采用四分法取约200 g样品。样品置于65 ℃烘箱中烘干48 h，粉碎，过40目制成风干样。干物质和粗蛋白的含量参照国际标准AOAC（2005）进行测定，其中干物质含量采用烘干重量法测定；粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维采用尼龙袋法测定[11]，利用纤维分析仪检测；可溶性碳水化合物采用蒽酮-硫酸比色法测定[12]；采用便携式pH酸度计测定青贮pH值。1.3.2微生物数量乳酸菌、霉菌和酵母菌的检测参照李小铃等[13]的方法，略有改动。在90 mL无菌生理盐水中加入10.0 g样品，4 ℃恒温振荡1 h，取出后制备10-1~10-7的梯度稀释液。采用菌落计数法统计各微生物数量。乳酸菌培养条件：在MRS固体培养基中37 ℃厌氧培养72 h。霉菌培养条件：在马丁培养基中25 ℃有氧培养72 h。酵母菌培养条件：在马铃薯葡萄糖培养基中25 ℃有氧培养72 h。数据均换算为以10为底的对数。1.3.3抗营养因子青贮高粱中单宁含量的测定，参照中华人民共和国国家标准《高粱 单宁含量的测定》（GB/T 15686—2008）进行。将青贮高粱样品加入20 mL二甲基甲酰胺溶液（75%）中，搅拌提取60 min，离心取上清液，随后添加柠檬酸铁铵溶液（3.5 g/L）和氨溶液（8.0 g/L）进行显色反应，以蒸馏水作为空白对照，在525 nm波长处使用分光光度计测定吸光度，采用单宁酸标准曲线对样品中单宁含量进行计算。同一样品测定2次取均值。青贮高粱中植酸含量的测定，参照中华人民共和国国家标准《食品中植酸的测定》（GB 5009.153—2016）进行。将青贮高粱样品加入40 mL硫酸钠-盐酸溶液中振荡2 h，5 000 r/min离心5 min，取上清液，经阴离子交换树脂（0.5 g）吸附以及随后解吸附，在500 nm波长处使用分光光度计测定吸光度，根据植酸钠（纯度≥85%）制作的标准曲线计算高粱样品中植酸含量。同一样品测定2次取均值。1.3.4瘤胃降解率试验动物选择3头装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦牛，体况良好、体重为（400±20）kg。根据《肉牛饲养标准》（NY/T 815—2004）配制并饲喂基础日粮，每日9：00、21：00饲喂2次，肉牛全天自由饮水，舍内自由活动。预试期10 d。随后将各处理组的青贮高粱样品置于瘤胃中进行消化试验。基础日粮组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.019.T002表2基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米秸秆60.00代谢能/(MJ/kg)9.25玉米21.96粗蛋白质/%13.72麸皮7.20中性洗涤纤维/%36.65豆粕3.60酸性洗涤纤维/%20.37棉籽饼5.20钙/%0.41菜籽粕1.00磷/%0.40食盐0.20磷酸氢钙0.04预混料0.80注：1.预混料购自长春兽大饲料有限公司。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。青贮高粱营养物质的瘤胃降解率采用尼龙袋法进行测定[11]。将装有5 g青贮样品的尼龙袋（规格10 cm × 5 cm；孔径50 μm）投入牛的瘤胃中后，分别在投入后24和48 h取出进行检测，检测指标包括干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的降解率。每头牛、每个样品、每个时间点均设置3个重复。R=A-BA (1)式中：A为瘤胃消化前样品某成分的质量（g），B为消化后样品某成分的质量（g），R为待测样品某成分的瘤胃降解率（%）。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 22.0软件进行整理和汇总，采用软件中的单因素方差分析模块对数据进行统计分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同微生物添加剂对青贮高粱营养成分的影响（见表3）由表3可知，各微生物处理组青贮高粱的粗蛋白含量均显著高于对照组（P0.05），其中以复合菌组含量最高，为5.86%，比对照组提高了17.91%。各微生物处理组高粱的可溶性碳水化合物含量显著低于对照组（P0.05），布氏乳杆菌组青贮高粱的可溶性碳水化合物含量最低，为3.28%。各微生物处理组青贮高粱的pH值均显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.019.T003表3不同微生物添加剂对青贮高粱中营养成分的影响项目干物质/%FW粗蛋白/%DM中性洗涤纤维/%DM酸性洗涤纤维/%DM可溶性碳水化合物/%DMpH值对照组23.554.97d40.2831.234.58a4.09a植物乳杆菌组24.185.26c40.4930.713.49c3.88c布氏乳杆菌组24.295.36b40.2130.593.28d3.97b复合菌组24.815.86a39.7829.223.88b3.81cSEM0.940.180.610.480.080.04P值0.4280.0500.8920.6230.0500.050注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4、表5与此同。2.2不同微生物添加剂对青贮高粱中微生物含量的影响（见表4）由表4可知，各微生物处理组青贮高粱的乳酸菌含量均显著高于对照组（P0.05），其中布氏乳杆菌组含量最高8.49 lgCFU/g，而复合菌组含量仅次于布氏乳杆菌组8.44 lgCFU/g，且两组间差异不显著（P0.05）。对照组霉菌含量最高，为2.14 lgCFU/g，显著高于各微生物处理组（P0.05），最低为复合菌组，为1.48 lgCFU/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.019.T004表4不同微生物添加剂对青贮高粱中各微生物含量的影响项目乳酸菌霉菌酵母菌对照组7.22c2.14a2.91植物乳杆菌组8.25b1.56c2.89布氏乳杆菌组8.49a1.75b3.01复合菌组8.44a1.48d3.12SEM0.350.280.53P值0.0500.0500.634lgCFU/g2.3不同微生物添加剂对青贮高粱中抗营养因子含量的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，各微生物处理组高粱的单宁含量显著降低（P0.05）。植物乳杆菌组、布氏乳杆菌组和复合菌组高粱的单宁含量比对照组分别降低了28.07%、24.56%和36.84%。复合菌组高粱的单宁含量显著低于植物乳杆菌组和布氏乳杆菌组（P0.05），植物乳杆菌组和布氏乳杆菌组高粱单宁含量较为接近。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.019.T005表5不同微生物添加剂对青贮高粱中抗营养因子含量的影响项目单宁/%植酸/(mg/g)对照组0.57a0.564 9a植物乳杆菌组0.41b0.353 1b布氏乳杆菌组0.43b0.364 9b复合菌组0.36c0.332 6bSEM0.020.005 7P值0.0500.050由表5可知，与对照组相比，各微生物处理组高粱的植酸含量显著降低（P0.05）。对照组高粱的植酸含量最高，为0.564 9 mg/g，植物乳杆菌组、布氏乳杆菌组和复合菌组高粱的植酸含量分别比对照组降低了37.49%、35.40%和41.12%。2.4不同微生物添加剂处理的青贮高粱对瘤胃降解率的影响（见表6）由表6可知，除24 h干物质降解率和24 h中性洗涤纤维降解率，微生物处理组高粱的降解率均显著高于对照组（P0.05）。复合菌组在4种营养物质的48 h降解率均为最高，48 h高粱的干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的降解率分别为73.96%、73.55%、69.79%和65.01%（P0.05）。植物乳杆菌组的24 h粗蛋白降解率最高，为60.32%；布氏乳杆菌组的24 h酸性洗涤纤维降解率最高，为52.51%。不同微生物添加剂对24 h的干物质降解率和中性洗涤纤维降解率均无显著影响（P0.05），表明在干物质和中性洗涤纤维的瘤胃降解初期，各处理组与对照组无差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.019.T006表6不同微生物添加剂处理的青贮高粱对瘤胃降解率的影响项目消化时间/h对照组植物乳杆菌组布氏乳杆菌组复合菌组SEMP值干物质降解率2460.3661.2862.8964.490.480.1534869.28d70.89c71.88b73.96a0.420.050粗蛋白降解率2455.28d60.32a57.89c58.36b0.290.0504869.48c72.49a70.39b73.55a0.340.050中性洗涤纤维降解率2445.2748.7246.9847.240.490.3274863.58b68.28a67.94a69.79a0.850.050酸性洗涤纤维降解率2446.58d49.42c52.51a50.26b0.790.0504859.27b63.72a63.99a65.01a0.580.050注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%3讨论3.1不同微生物添加剂对青贮高粱营养品质的影响青贮发酵广泛应用于青饲草的贮存，青贮可在延长青饲草保存时间的同时最大限度地保存饲料营养成分，通过快速降低发酵环境pH值抑制有害菌生长，以达到减少营养损耗的目的。一般认为优质青贮的pH值应在3.8~4.2之间[14]。本研究中，4个处理组发酵70 d后的pH值均低于4.2，其中以复合菌处理组表现最优，与贾婷婷等[15]研究结果一致，表明在青贮中加入同型+异型混合发酵乳酸菌更利于优质青贮形成。青贮中各营养成分含量是评价青贮发酵品质的重要指标，青贮的干物质、粗蛋白、可溶性碳水化合物含量高，一般被认为是青贮品质好的标志[16]。本研究中，青贮70 d后，各微生物处理干物质含量均略高于对照组，但差异不显著，其中以复合菌处理组含量最高（24.81%）。原因可能是在乳酸菌微生物发酵，特别是混合菌发酵时，菌株生长较快，使青贮环境迅速酸化，能够较早地抑制有害细菌滋生，从而减少杂菌对干物质的损耗，且这一结果与pH值结果较吻合。本研究结果显示，各微生物处理组青贮高粱的粗蛋白含量均显著高于对照组，复合菌处理组的粗蛋白含量最高，达5.86%，比对照组提高了17.91%，表明同型或异型乳酸菌均可较好地抑制青贮高粱中粗蛋白降解，且同型+异型混合乳酸菌比单菌的青贮效果更好。本研究结论与付薇等[10]结论一致，不同发酵乳酸菌剂及其组合均可不同程度改善地甜青贮高粱发酵品质。本研究结果显示，所有处理组高粱的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量并无显著变化。孙向丽等[17]研究发现，添加布氏乳杆菌和植物乳杆菌的处理组，其青贮高粱的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均低于对照组，与本研究结论不一致。原因可能是不同研究选择的乳酸菌在菌种、混合比例和菌液浓度等方面均有不同程度差异，从而导致其对青贮的影响不同，具体原因还需进一步探索。3.2不同微生物添加剂对青贮高粱中微生物含量的影响青牧草表面通常附着许多微生物，包括酵母菌、霉菌和普通细菌等，要获得发酵品质较好的青贮饲料需要抑制有害菌滋生，提高乳酸菌数量[18]。本研究结果显示，各微生物处理组青贮高粱的乳酸菌含量均显著高于对照组，布氏乳杆菌组和复合菌组的乳酸菌含量均显著高于其余各组，分别为8.49和8.44 lgCFU/g；同时各微生物处理组均能够有效抑制霉菌生长，以复合菌组效果最好。杨宝钰[19]利用瘤胃液处理甜高粱，结果发现，随着发酵时间延长，各处理组微生物Alpha多样性差异显著，优势菌群抑制了有害菌生长，且乳杆菌属在各处理组优势菌群相对丰度中均为最高。赵嫚等[20]研究发现，微生物添加剂利于秸秆青贮，在发酵过程中使乳酸菌占优势地位，从而有效抑制青贮过程中杂菌生长。本研究结果与上述结论相似，表明异型发酵乳酸菌青贮过程中能够产生大量乙酸，从而抑制真菌生长，对保存饲料营养价值具有促进作用。3.3不同微生物添加剂对青贮高粱中抗营养因子含量的影响单宁和植酸等是高粱中主要的抗营养因子成分，能够通过影响氨基酸的吸收和利用，降低高粱的饲用价值。单宁可与蛋白质作用生成难分解的高分子沉淀，降低胃肠道中消化酶活性，影响动物对饲料中蛋白质的消化利用[21]。本研究显示，经过70 d青贮，各微生物处理组的单宁含量显著低于对照组，分别比对照组降低28.07%、24.56%和36.84%，以复合菌处理组减少最多。原因可能是乳酸菌群在发酵过程中产生单宁酶或多酚氧化酶，水解了谷物中的单宁[22]。但目前对于该观点仍存在一定分歧，不同微生物产生单宁降解酶的过程、产量存在较大差异。也有研究发现，微生物发酵并未对单宁起明显的降解作用。Elyas等[23]研究发现，室温发酵36 h后，发酵样品的单宁含量并未发生显著变化。因此，建议制作青贮高粱前需要仔细对微生物添加剂进行测试和筛选。植酸主要通过与Ca2+、Fe3+和Zn2+等营养元素结合，形成螯合物，阻碍矿物质的有效吸收[24]。本研究结果显示，各微生物处理组的植酸含量显著低于对照组，分别比对照组下降了37.49%、35.40%和41.12%，其中以复合菌组减少最多；各微生物处理组的植酸含量较为接近，差异不显著。结果表明，乳酸菌不论是单菌还是复合菌种均可较好地降低青贮高粱中植酸的含量。乳酸菌发酵可以降低植酸含量的原因可能为以下两点：发酵导致环境pH值下降，达到植酸酶最适pH值时激活植酸酶，加快了对植酸的分解[25]；发酵过程中微生物产生了植酸酶。目前后一种观点接受范围更广。研究发现，可选择在高粱基础日粮中直接添加外源性单宁降解消化酶、植酸酶降低饲料中单宁、植酸等抗营养因子的含量，促进动物对饲料的吸收和利用[26-27]。3.4不同微生物添加剂处理的青贮高粱对瘤胃降解率的影响反刍动物瘤胃对饲料中营养物质利用受饲料中干物质、粗蛋白和纤维素的含量及降解率的影响较大[28]。本研究中，除干物质和中性洗涤纤维24 h降解率外，微生物处理组的其他降解率均显著高于对照组；复合菌处理组4种高粱的营养物质48 h降解率均最高，高粱的干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的48 h降解率分别为73.96%、73.55%、69.79%和65.01%。与Filya等[29]和刘桃桃等[30]的研究结果相似，在高粱、玉米等饲草上接种乳酸菌可提升青贮各营养物质的24和（或）48 h瘤胃降解率。原因可能是微生物在青贮过程中，改善了高粱细胞壁的纤维素结构，破坏纤维的密闭结构；或通过水解降低纤维含量，进而影响干物质、粗蛋白质以及纤维素的瘤胃降解率。因此，在青贮高粱中添加同型/异型乳酸菌，特别是同型+异型复合乳酸菌可较有效地提升青贮高粱饲料营养物质消化率。当中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的降解率提高时，则利于提高反刍动物干物质采食量，提高反刍动物的生产性能。4结论本研究结果表明，植物乳杆菌组、布氏乳杆菌组和复合菌组（植物乳杆菌+布氏乳杆菌）对青贮高粱的营养价值、抗营养因子和瘤胃降解率均有不同程度提升作用。综合评价，复合菌组（植物乳杆菌+布氏乳杆菌）的青贮高粱饲喂价值最高。