天然植物，尤其是具有药食同源特性的天然植物在我国具有悠久的应用历史[1]。2018年，全国饲料工业标准化技术委员会出台的国家标准《天然植物饲料原料通用要求》确立了天然植物及其粗提物作为饲料原料存在天然植物干燥物、天然植物粉碎物和天然植物粗提取物3种基本形式，避免行业内对天然植物原料与天然植物添加剂混淆不清的状况[2]。目前，市面上天然植物饲用原料缺少相关质量控制标准的问题。因此，对天然植物饲料原料的质量安全进行科学风险预警监测，同时进一步保障天然植物饲料原料的质量安全显得十分必要[3-4]。特征图谱技术作为一种现代分析手段，具有专属性、可靠性、模糊性、可量化等优点，为然植物饲料原料质量安全研究提供新思路[5-6]。厚朴是木兰科木兰属植物厚朴（Magnolia officinalis Rehd. et Wils）.或凹叶厚朴（Magnolia officinalis subsp. biloba （Rehd. et Wils.） Cheng.）的干燥干皮、根皮和枝皮，是农业农村部公告《饲料原料目录》中明确的可作为饲料原料使用的117种具有药食同源性的天然植物之一[3]。主要含有木脂素类、生物碱、黄酮、挥发油及多糖等活性成分[6-10]。厚朴的药理作用十分广泛，主要对消化[11]、神经[12]、心血管[12-13]以及呼吸系统起作用[14]，对糖脂代谢有较为明显的影响，具有抗炎、镇痛、抗病原微生物、抗肿瘤、抗氧化等药理作用[15]。本研究按照《中国兽药典》通则中高效液相色谱法的要求建立分析方法，构建饲用植物厚朴粗提物的特征图谱，为厚朴粗提物的质量评价以及此类产品在行业中的规范使用提供参考。1材料与方法1.1试验仪器Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）、移液枪（德国Eppendorf公司）、TG16-WS离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）、KQ5200DE型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）、NewClassic ME电子天平（METTLER TOLEDO）、色谱柱Unitary C18 （4.6 mm×250 mm，5 µm）。1.2试验材料无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产）；乙腈（色谱纯，Merck）；超纯水（Milli-Q水系统）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产）；厚朴对照药材、对照品厚朴酚（191105，≥98%）和厚朴酚（191123，≥98%），均购自上海融禾医药科技发展有限公司。1.3样品从亳州、安国、廉桥3地的药材市场收集34批厚朴样品。经鉴定，均为木兰科植物厚朴。采购信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.022.T001表1药材采购信息序号编号部位原产地序号编号部位原产地1BZ-SC-01枝皮四川18YZ-SC-04根皮四川2BZ-SC-02枝皮四川19YZ-SC-05根皮四川3BZ-SC-03枝皮四川20YZ-HN-01根皮湖南4BZ-SC-04枝皮四川21YZ-HN-02枝皮湖南5BZ-SC-05枝皮四川22YZ-HN-03枝皮湖南6BZ-SC-06枝皮四川23YZ-HB-01枝皮河北7BZ-SC-07枝皮四川24AG-SC-01枝皮四川8BZ-SC-08枝皮四川25AG-GZ-02枝皮贵州9BZ-SC-09枝皮四川26AG-SC-03枝皮四川10BZ-SC-10枝皮四川27AG-SC-04枝皮四川11BZ-SC-10S枝皮四川28AG-GZ-05枝皮贵州12BZ-SC-11枝皮四川29AG-SC-06枝皮四川13BZ-SC-12枝皮四川30AG-GZ-07枝皮贵州14BZ-SX-01枝皮陕西31LQ-GX-01枝皮广西15YZ-SC-01枝皮四川32LQ-YZ-01枝皮河南16YZ-SC-02根皮四川33LQ-SC-01枝皮四川17YZ-SC-03根皮四川34LQ-SC-02枝皮四川1.4试验方法1.4.1色谱柱色谱柱为Unitary C18 (4.6 mm×250 mm，5 µm)；以乙腈（A）和0.1%磷酸水（B）为流动相，梯度洗脱，0~5 min，5% A；5~20min，5%~20% A；20~35 min，20%~70% A；35~55 min，70%~90% A；55~60 min，90% A；体积流量为1 mL/min；进样量为10 μL；柱温为30 ℃；检测波长为294 nm。1.4.2样品的前处理将上述收集到的厚朴样品晒干粉碎，将厚朴粉碎物过1号筛，取粉碎过筛后的厚朴样品100 g，用70%乙醇回流提取2次，每次1 h，溶剂加入量依次为分别用800 mL和500 mL的过滤，合并提取液，滤液减压回收乙醇至稠膏状，冷冻干燥，得到黑色粉末。1.4.3溶液的制备1.4.3.1供试品溶液的制备称取样品粉末约0.20 g，置25 mL具塞锥形瓶中，精密加入乙醇-水（70∶30）25 mL，密塞，超声处理（功率400 W，频率37 kHz）30 min，取出，放冷至室温。取适量提取液于10 mL离心管中，12 000 r/min 离心10 min；取上清液12 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，取续滤液于液相色谱小瓶中，备用。1.4.3.2参照物溶液的制备分别精密称定厚朴酚、和厚朴酚对照品各5.0 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，加乙醇-水（70∶30）超声溶解定容至刻度，制成浓度为0.2 mg/mL的参照物储备液，于4 ℃下冷藏备用。1.4.4方法学考察1.4.4.1精密度试验取S1样品约0.20 g，精密称定，按“1.4.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“1.4.1”项下色谱条件连续进样6次，进样量为10 μL，并记录色谱图。以7号峰为参照峰（S），8个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于2%和4%，说明该方法的精密度符合分析方法的要求。1.4.4.2稳定性试验取S1样品约0.20 g，精密称定，按“1.4.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、3、4、5、6、12以及24 h按“1.4.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以7号峰为参照峰，各特征峰以及S峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于2%和3%，说明该方法稳定。1.4.4.3重复性试验精密称定S1样品6份，每份约0.20 g，按“1.4.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“1.4.1”项下色谱条件进样，并记录色谱图。以7号峰为参照峰，各特征峰以及S峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于2%和5%，说明该方法的重复性满足要求。2结果与分析2.1特征图谱的建立将34批厚朴粗提物样品，按照“1.4.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“1.4.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。采用仪器自带软件将所有色谱图叠加，根据叠加图谱中色谱峰分布，选择各批次共有色谱峰作为特征峰，建立统一处理方法处理各批次样品色谱图，确保每一批次特征峰均能被积分，再将色谱数据转化为*.AIA格式，将格式转化后的文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版），“时间窗宽度”设定为0.2，进行多点校正。通过仪器自带软件和中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）二次验证。共有特征峰在34批样品中均能识别，最后得到34批样品叠加图，并建立厚朴粗提物特征图谱的对照图谱（R），结果见图1、图2。通过两种方式，最终确定8个共有特征峰，按出峰时间依次标记为1~8号峰。以上指认特征峰均为厚朴中的特征峰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.022.F001图134批厚朴粗提物的叠加图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.022.F002图234批厚朴粗提物的HPLC特征图谱2.2参照峰的指认参考药典，初步选定和厚朴酚、厚朴酚为对照品。为考察特征图谱是否具有代表性以及能否表征待测所含成分的专属性，通过对照品的HPLC谱图比对，明确保留时间为38.49 min为和厚朴酚（7号峰），鉴于和厚朴酚为厚朴的主要有效成分，峰强度高，且保留时间适中。因此设定其为参照峰（S峰）；同时计算上述8个特征峰的相对保留时间（见表2）和相对峰面积（见表3）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.022.T002表234批厚朴粗提物特征图谱中8个特征峰的相对保留时间样品编号1 号峰2 号峰3 号峰4 号峰5 号峰6 号峰7 号峰8 号峰AG-SC-010.4500.5240.8580.6101.4060.4341.0000.434AG-GZ-020.4500.5240.8590.6101.4070.4341.0000.434AG-SC-030.4500.5240.8580.6111.4050.4351.0000.435AG-SC-040.4490.5240.8570.6121.4000.4371.0000.437AG-GZ-050.4490.5240.8570.6111.4020.4361.0000.436AG-SC-060.4490.5240.8570.6121.4000.4371.0000.437AG-GZ-070.4490.5240.8560.6121.3980.4381.0000.438BZ-SC-010.4490.5240.8560.6131.3960.4391.0000.439BZ-SC-020.4480.5240.8550.6131.3960.4391.0000.439BZ-SC-030.4480.5240.8560.6121.3980.4381.0000.438BZ-SC-040.4480.5240.8550.6131.3960.4391.0000.439BZ-SC-050.4480.5240.8550.6131.3940.4401.0000.440BZ-SC-060.4480.5240.8540.6141.3930.4411.0000.441BZ-SC-070.4460.5240.8510.6161.3820.4461.0000.446BZ-SC-080.4510.5240.8600.6091.4110.4321.0000.432BZ-SC-090.4530.5240.8650.6061.4260.4251.0000.425BZ-SC-100.4530.5240.8630.6071.4220.4271.0000.427BZ-SC-10S0.4530.5240.8650.6051.4290.4241.0000.424BZ-SC-110.4540.5240.8660.6051.4300.4241.0000.424BZ-SC-120.4440.5240.8480.6181.3730.4501.0000.450BZ-SX-010.4530.5240.8650.6061.4270.4251.0000.425LQ-GX-010.4490.5240.8560.6131.3970.4381.0000.438LQ-SC-010.4480.5250.8550.6141.3930.4411.0000.441LQ-SC-020.4480.5240.8540.6141.3900.4421.0000.442LQ-YZ-010.4470.5240.8530.6151.3860.4441.0000.444LQ-HB-010.4470.5240.8520.6151.3850.4441.0000.444YZ-HN-010.4460.5240.8520.6151.3860.4431.0000.443YZ-HN-020.4460.5240.8520.6151.3840.4441.0000.444YZ-HN-030.4460.5240.8510.6161.3820.4461.0000.446YZ-SC-010.4460.5240.8510.6161.3830.4451.0000.445YZ-SC-020.4500.5240.8590.6111.4060.4341.0000.434YZ-SC-030.4480.5240.8550.6131.3940.4401.0000.440YZ-SC-040.4480.5240.8540.6141.3920.4411.0000.441YZ-SC-050.4470.5240.8530.6151.3870.4431.0000.443平均值0.4490.5240.8560.6121.3990.4380.438RSD/%0.5110.0330.5150.5181.0361.5421.54210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.022.T003表334批次厚朴粗提物特征图谱中8个特征峰的相对峰面积样品编号1 号峰2 号峰3 号峰4 号峰5 号峰6 号峰7 号峰8 号峰AG-SC-010.0120.5490.1140.2580.9770.7921.0003.017AG-GZ-020.0630.0990.0390.0550.2990.6021.0001.304AG-SC-030.0400.0930.0340.0620.1660.2581.0001.777AG-SC-040.0630.2220.0950.1210.7530.5011.0002.219AG-GZ-050.0060.0600.0150.0380.1080.2701.0001.116AG-SC-060.0020.2880.0460.1100.2810.2211.0001.141AG-GZ-070.0030.0030.0010.0020.0090.0101.0000.895BZ-SC-010.0810.4680.0820.1841.1500.5421.0002.184BZ-SC-020.1711.2680.2070.4512.1901.1381.0003.037BZ-SC-030.0870.6490.1300.2530.8660.4981.0001.534BZ-SC-040.3972.6710.5060.9964.3922.5861.0004.021BZ-SC-050.1070.5190.1790.2611.5051.1721.0001.932BZ-SC-060.1000.6300.0930.2381.2310.8371.0003.220BZ-SC-070.0050.0110.0020.0040.0190.0361.0000.789BZ-SC-080.0991.3580.1860.4991.7461.0211.0002.441BZ-SC-090.0600.6490.0880.2900.6180.4081.0002.242BZ-SC-100.1410.6720.1250.2651.7870.9571.0002.372BZ-SC-10S0.1060.4090.0730.1551.1390.8281.0001.769BZ-SC-110.0830.3810.0870.1901.1130.6951.0001.636BZ-SC-120.0841.0880.1930.3940.7780.5601.0001.683BZ-SX-010.1100.9270.1820.3691.2360.7651.0002.353LQ-GX-010.0410.0310.0140.0280.2020.2571.0002.059LQ-SC-010.0210.0200.0050.0120.0480.0671.0002.289LQ-SC-020.0660.3690.0720.1850.7610.4881.0003.478LQ-YZ-010.0010.0200.0030.0100.0390.0661.0001.309LQ-HB-010.0180.7030.1700.3331.6321.1801.0003.313YZ-HN-010.2982.1520.2460.7113.2472.5271.0004.542YZ-HN-020.0070.7290.1600.3611.1960.9411.0003.014YZ-HN-030.0390.4930.1410.2340.8271.1521.0002.128YZ-SC-010.1380.7850.1880.4521.8750.9711.0003.735YZ-SC-020.1290.6860.1450.3981.8740.9091.0002.888YZ-SC-030.1460.6970.1890.4061.9791.4021.0003.620YZ-SC-040.0580.2180.0920.1440.7260.4871.0002.180YZ-SC-050.0670.5770.1980.7851.9820.7681.0003.826平均值0.0840.6030.1210.2721.1400.7622.384RSD/%98.77196.71381.29484.77883.85076.91240.177由表2、表3可知，不同批次样品特征峰相对保留时间相对稳定，RSD小于2%说明出峰时间相对稳定，利用参照峰对特征峰进行定性准确可行，但相对峰面积差异较大，说明特征峰受产地、采收季节、采收方式影响较大。3讨论3.1粗提物的选择根据《天然植物饲料原料通用要求》，天然植物粗提物具有醇提物和水提物两种形态，厚朴中的主要活性物质和厚朴酚、厚朴酚水溶性差。同时水提物的液相图谱中显示其中化合物数量较少。所以选择厚朴醇提物进行特征图谱研究。3.2提取方式优化为确保厚朴粗提物主要成分最大限度地转移到溶液中，便于样品测定。由于厚朴粗提物是经70%乙醇回流提取、浓缩、干燥而得，所以其主要成分均易溶于70%乙醇中，因此选用70%的乙醇作为溶剂，并对溶剂的用量和提取方式进行考察，三种不同提取方式分别为0.1、0.2、0.5 g厚朴粗提物用25 mL 70%的乙醇提取。最终确定，0.2 g厚朴粗提物经25 mL 70%乙醇超声30 min，可全部溶解。3.3分离方法的优化本试验分别考察了Unitary C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）、Sunfire（4.6 mm×250 mm，5 µm）、Diamonsil（4.6 mm×250 mm，5 µm）三根色谱柱对厚朴中主要色谱峰分离的影响，评估分离度、峰形、出峰时间等因素，结果表明不同色谱柱对分离效果影响不大，故该试验选择Unitary；对样品进行全波长扫描结果多数色谱峰的最大吸收波长为294 nm，且在最大吸收波长下样品测定结果中色谱峰数量及响应程度均优于其他波长，因此选择294 nm作为数据采集波长。流动相的流速越大，被分离物质出峰时间越快，响应高；较小的流速会造成分析时间过长，色谱峰展宽，造成拖尾、响应变低等后果。考察不同流速对厚朴粗提物中主要有效成分分离的影响，结果表明流速为1.2 mL/min时有部分成分未能完全分离， 0.8 mL/min时分离效果与1.0 mL/min相近，但分离时间过长，故该流速为1.0 mL/min；考察柱温25、30、35 ℃对厚朴粗提物中主要有效成分分离的影响，结果表明不同柱温对分离效果影响不大。考察进样量为3、5、10 µL对厚朴有效成分分离的情况，结果表明进样量为3 µL和5 µL时厚朴粗提物有效成分色谱峰响应偏低，故选择10 µL作为本试验的进样量。综合考虑选择色谱柱Unitary C18、采集波长294 nm、流速1.0 mL/min。柱温30 ℃、进样量10 mL作为分离条件。3.4相对峰面积比值一般情况下对提取物特征图谱中特征峰与S峰的峰面积比值（相对峰面积比值）范围不做强制要求，本34批样品的由于采购自不同的药材市场，受产地、采收季节，采收方式等因素的影响，相对峰面积比值差异较大。申请者可以通过固定产地、采收期等方式，从而实现质量稳定可控。此时可以对提取物特征图谱中特征峰与S峰的相对峰面积比值范围进行限定，进一步保障药用植物提取物的质量可控性。4结论本试验采用HPLC梯度洗脱法建立了药用植物厚朴醇提物的特征图谱。采用两种方式结合的方式指认了8个共有特征峰，并指认了和厚朴酚作为参照峰。该方法的精密度、重复性、稳定性都能达到要求。可用于对厚朴醇提物的质量进行控制。