蛋白质是构成体细胞、抗体、免疫激素、酶等的主要成分，是生命活动的物质基础。畜禽饲料中粗蛋白质（CP）含量直接影响动物的生长速度、新陈代谢、繁殖性能和生产性能。饲料中CP含量是评定饲料营养价值的重要指标之一，因而准确测定饲料中CP含量尤为重要[1-2]。饲料中CP检测的方法主要包括凯氏定氮法、强碱直接蒸馏法、近红外光谱法、过氧化氢测定法、双缩脲法、原子荧光分光光度计法，其中最常用的是凯氏定氮法[3-4]。凯氏定氮法的原理是饲料样品中加入浓硫酸和催化剂，在消煮炉中进行加热消化，破坏蛋白质结构，分解试样中的蛋白质。碳和氢被氧化为二氧化碳和水而逸出。有机氮转化为氨态氮，之后结合硫酸生成硫酸铵。在消化液中加碱进行蒸馏使氨逸出，使用硼酸将其吸收，再用标准浓度盐酸滴定，根据标准酸的消耗量计算CP含量[5-8]。即凯氏定氮法测定CP的过程包括消化、蒸馏、吸收和滴定，每个环节均存在影响CP含量测定的因素[9-10]。在确保测定结果准确性的前提下，缩短检测时间、降低试验成本、提高试验效率是饲料CP测定需要改进的首要问题。有研究报道，硒粉是一种高效催化且抑泡的催化剂，且不影响试样CP含量[11]。本试验在添加硒粉的前提下，从不同消化温度、催化剂用量、浓硫酸用量、消化时间和蒸馏时间等方面进行优化，研究对饲料CP测定的影响，旨在筛选最佳的测定条件。1材料与方法1.1试验材料小麦麸和菜籽粕由西北农林科技大学实验教学基地提供。采用四分法进行采样，粉碎，过40目筛，制成待试样品。1.2主要试剂五水硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、碳酸钠、硼酸、硫酸铵、硒粉，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；甲基红、溴甲酚绿，购自国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸（98%）、浓盐酸，购自上海源叶生物科技有限公司。以上试剂均为分析纯。1.3主要仪器KDN-AA半自动凯氏定氮仪（上海新嘉电子科技有限公司）、AED－AV消化炉（北京博瑞赛仪器有限公司）、DHG-9123鼓风干燥箱（湖南湘仪仪器有限公司）、FW-500D粉碎机（天津鑫博得仪器有限公司）、ATY220分析天平（岛津有限公司）。1.4试剂配制混合催化剂：准确称取10 g五水硫酸铜、100 g硫酸钾、2 g硒粉，粉碎混匀，常温干燥处保存。40% NaOH溶液：准确称取400 g氢氧化钠，蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。混合指示剂：准确称取0.1 g甲基红，使用无水乙醇溶解，定容至100 mL，制成甲基红0.1%的乙醇溶液；准确称取0.5 g溴甲酚绿，无水乙醇将其溶解，定容至100 mL，制成溴甲酚绿0.5%的乙醇溶液；将两者等体积混合，装于棕色试剂瓶，4 ℃冰箱保存。2%硼酸溶液：准确称取20 g硼酸，蒸馏水将其溶解，定容至1 000 mL。0.1 mol/L盐酸标准溶液：用移液管准确移取8.3 mL浓盐酸，缓慢注入蒸馏水中，摇匀，定容至1 000 mL，采用碳酸钠标定。1.5测定指标及方法1.5.1消化温度对CP含量测定的影响采用分析天平称取试样0.5 g（精确至0.000 2 g），将试样放入干净的消化管底部（每个消化温度称取5个平行样），加入3 g混合催化剂，使其与试样混匀。向消化管中加入12 mL浓硫酸，采用程序升温（260 ℃消化30 min，300 ℃消化30 min），待试液清亮后分别置于360、380、400、420、440 ℃的消化炉上消化2 h，待消化管中液体彻底透明清亮，结束消化。将碱管和水管分别插入装有40%氢氧化钠溶液和蒸馏水的桶中，设定加碱量为5 mL和蒸馏时间为8 min，打开冷凝水和电源，对凯氏定氮仪管路清洗3~5次，将消化管置于凯氏定氮仪，同时使用装有20 mL 2%硼酸和2滴混合指示剂的三角瓶吸收氨气。蒸馏结束，使用0.1 mol/L盐酸标准溶液滴定吸收液，当溶液由蓝绿色变成灰红色为滴定终点，记录盐酸用量。1.5.2混合催化剂用量对CP含量测定的影响在最适消化温度（1.5.1筛选确定）下，准确称取试样0.5 g（精确至0.000 2 g），将试样放入消化管底部（每个催化剂用量称取5个平行样），加入2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g混合催化剂，向消化管中缓慢加入12 mL浓硫酸，程序升温待试液清亮后于消化炉消化2 h，后续测定方法同上。1.5.3硫酸用量对CP含量测定的影响在最适消化温度（1.5.1筛选确定）下，准确称取试样0.5 g（精确至0.000 2 g），将试样放入消化管底部（每个硫酸用量称取5个平行样），加入适量混合催化剂（1.5.2筛选确定），再加入5、10、12、15 mL浓硫酸，程序升温待试液清亮后于消化炉消化2 h，后续测定方法同上。1.5.4消化时间对CP含量测定的影响在最适消化温度（1.5.1筛选确定）下，准确称取试样0.5 g（精确至0.000 2 g），试样放入干净的消化管底部（每个消化时间称取5个平行样），加入适量混合催化剂（1.5.2筛选确定），再加入适量浓硫酸（1.5.3筛选确定），程序升温待试液清亮后于消化炉消化0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，后续测定方法同上。1.5.5蒸馏时间对CP含量测定的影响采用上述方法继续称样25个，用最佳消化条件（消化温度、消化时间、混合催化剂用量、浓硫酸用量）消化，将蒸馏时间设为4、5、6、7、8 min，每个时间点蒸馏5个样，作为平行。滴定方法同上。1.5.6空白试验精确称取0.5 g蔗糖代替试样，按上述步骤进行空白测定，记录0.1 mol/L盐酸标准溶液的体积。1.5.7回收试验精确称取硫酸铵0.2 g代替试样，按上述步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量和回收率。1.5.8对比试验使用分析天平准确称取菜籽粕试样1.0 g（精确至0.000 2 g），每种方法称取5个平行样，用优化后的条件和国标法进行测样比较。1.5.9饲料中CP含量测定CP(%)=c×(V1-V2)×0.001 4×6.25/m×100% (1)式中：c为盐酸标准溶液的物质的量浓度（mol/L）；V1为滴定试样时所需的标准盐酸溶液体积（mL）；V2为滴定空白时所需的标准盐酸溶液体积（mL）；0.001 4为1 mL的0.1 mol/L盐酸相当的氮的质量；m为样品的质量（g）。1.6数据统计与分析试验数据采用Microsoft Excel进行整理和初步计算，SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同消化温度对CP含量的影响（见图1）由图1可知，随着消化温度的升高，两种饲料CP含量均呈先升高、后降低的趋势。消化温度400 ℃和420 ℃时，两种饲料的CP含量均明显高于其余各消化温度时的含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.021.F001图1不同消化温度对CP含量的影响2.2不同混合催化剂用量对CP含量的影响（见图2）由图2可知，随着催化剂用量增加，两种饲料的CP含量呈先增加、后趋于基本稳定的趋势。当催化剂用量为3.0、3.5和4.0 g时，两种饲料CP含量明显高于其余催化剂用量时的含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.021.F002图2不同混合催化剂用量对CP含量的影响2.3不同硫酸用量对CP含量的影响（见图3）由图3可知，随着浓硫酸用量的增加，CP含量呈增加趋势。当浓硫酸用量达10 mL以上，两种饲料CP含量基本稳定。浓硫酸用量为10 mL和12 mL时，两种饲料CP含量均无显著差异，但明显高于浓硫酸用量为5 mL时的含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.021.F003图3不同硫酸用量对CP含量的影响2.4不同消化时间对CP含量的影响（见图4）由图4可知，消化1.5和2.0 h时，测得两种饲料CP含量明显高于消化0.5 h的含量。消化1.5 h所测CP含量高于消化2.0 h。消化2.5 h时，两种饲料的CP含量均出现下降趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.021.F004图4不同消化时间对CP含量的影响2.5不同蒸馏时间对CP含量的影响（见图5）由图5可知，蒸馏时间5~7 min时，两种饲料CP含量变化趋势平缓，且均明显高于蒸馏4 min时的CP含量。蒸馏时间为8 min时，蛋白质含量呈下降趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.021.F005图5不同蒸馏时间对CP含量的影响2.6空白试验和回收试验测定结果（见表1）由表1可知，5次空白试验的盐酸用量均值为0.2 mL，5次硫酸铵回收试验所测硫酸铵的含氮量均值为21.10%，硫酸铵回收率均值为99.98%。与伊丽君等[12]报道的半自动凯氏定氮仪硫酸铵回收率为99.5%~100.5%的结果一致，表明本测定方法具有较高的准确度和精密度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.021.T001表1空白试验和回收试验测定结果项目空白试验盐酸体积/mL硫酸铵回收率/%硫酸铵含氮量/%结果0.20±0.0499.98±0.2821.10±0.172.7优化法和国标法对CP含量测定的比较（见表2）由表2可知，优化法较国标法减少了混合催化剂用量和浓硫酸用量，缩短了消化时间，降低了消化温度。两种方法对CP测定结果无明显影响，优化法的相对标准偏差明显低于国标法。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.021.T002表2优化法和国标法对CP含量测定的比较项目国标法优化法混合催化剂0.4 g硫酸铜+6 g硫酸钾0.2 g硒粉+0.2 g硫酸铜+3 g硫酸钾浓硫酸用量/mL1210消化温度/℃420400消化时间/h2.01.5蒸馏时间/min55CP含量/%36.34±0.1336.36±0.13相对标准偏差/%0.250.163讨论3.1消化温度对饲料CP含量测定的影响消化温度是凯氏定氮法测定饲料CP过程中直接影响消化速度和结果的主要因素[13-14]。《饲料中粗蛋白测定方法》（GB/T 6432—1994）中规定消化温度为360~410 ℃[15]。本试验结果发现，在360 ℃消化的两种饲料CP含量均最低，明显低于400和420 ℃，可能是由于消化温度偏低，不利于蛋白质的消化；当温度为440 ℃时，两种饲料CP含量低于400和420 ℃时的CP含量，可能是消化温度太高，导致含氮物质以气体形式损失，造成测定结果偏低。且在360和380 ℃消化的消化管中均稍有黑色不透明物存在，而其他温度下的消化管均为清亮透明。试验结果表明，消化温度为400和420 ℃时的消化效果最佳，与王有生等[16]的结论一致。3.2不同量混合催化剂对CP含量测定的影响在消化过程中，催化剂的作用是提高浓硫酸的沸点，加快样品的消化效率。本研究中，随着混合催化剂用量的增大，两种饲料的CP含量均呈增加趋势，在催化剂用量达3 g以后，饲料CP含量趋于稳定。试验结果表明，催化剂用量太少，在相同的消化条件下，样品消化不完全，结果与李敏等[17]的研究结论一致。3.3不同量浓硫酸对CP含量测定的影响凯氏定氮法中，利用浓硫酸的脱水作用使饲料样品中的有机物脱水后炭化，并生成二氧化硫，同时利用浓硫酸吸收蛋白质和氨态氮转变成的氨气，可以生成硫酸铵[18]。《饲料中粗蛋白测定方法》（GB/T 6432—1994）[15]中规定浓硫酸用量为12 mL。本试验中，浓硫酸用量为12和15 mL时，两种饲料测得CP含量差异不显著。为了环境友好和节约试剂，确定浓硫酸的最佳用量为10 mL。3.4不同消化时间对CP含量测定的影响凯氏定氮法测定CP所需消化时间受催化剂用量、硫酸用量和消化温度的影响。消化时间对饲料中CP测定结果影响很大。消解时间太短，消化不完全；消解时间太长，会导致氨的损失。本试验结果表明，消化0.5 h时，两种饲料CP含量偏低，表明消化时间短，消化不完全；消化时间大于1.0 h，两种饲料可完全消化；若消化时间超过2.5 h，CP含量呈降低趋势，表明消化时间太长，造成氨的流失。因此，最佳消化时间控制在1.5 h为宜。3.5不同蒸馏时间对CP含量测定的影响两种饲料蒸馏4 min时，CP含量均偏低，可能是消化管内游离氨未被完全蒸发；当蒸馏时间在5~7 min时，随着蒸馏时间的延长，两种饲料CP含量未发生明显变化，表明消化管中的游离氨已被全部蒸馏，并被硼酸完全吸收；当蒸馏时间为8 min时，随着蒸馏时间的延长，锥形瓶中的蒸馏液体太多，影响后续的滴定试验，可能出现测定结果偏低的现象。4结论通过分析不同条件对半自动凯氏定氮仪测定饲料中CP含量的影响，并用优化后的条件与国标法进行比较试验。结果显示，蛋白质最佳测定条件为消化温度400 ℃、催化剂用量3.0 g、浓硫酸用量10 mL、消化时间1.5 h、蒸馏时间5 min。本研究为建立一种高效、低耗、准确测定饲料CP的方法提供参考。