贵德黑裘皮羊是我国青藏高原地区藏羊的特殊经济类型，主要分布在我国青海省贵南县，以产黑紫羔二毛皮而闻名[1]。贵德黑裘皮羊所产出的羔皮皮板坚韧、轻软、毛色乌黑发亮、毛质细腻、毛辫不易黏结、毛卷花紧实美观，呈环状或半环弯曲状，是我国裘用羊羔皮中的珍品[2]。在20世纪80年代中期，引进其他品种的羊与贵德黑裘皮羊进行杂交，导致品种优质资源纯度下降，羔羊皮的品质也随之下降。种质资源的下降曾一度让贵德黑裘皮羊面临绝种的危险[3]。因此，农业农村部多次将贵德黑裘皮羊确定为国家级遗传资源保护品种，2014年颁布的《中国国家级畜禽遗传资源保护名录》确定159个畜禽品种为国家级畜禽遗传资源保护品种，贵德黑裘皮羊名列其中[4]。因此，对贵德黑裘皮羊进行群体系统发育的分析，对今后开展贵德黑裘皮羊遗传育种及资源保护和合理利用工作具有重要意义。线粒体DNA（mtDNA）是动物细胞唯一一种核外遗传物质，与核内DNA相比，分子量较小、进化速度较快、不与组蛋白结合而裸露并具有严格的母系遗传、突变率高等特点。线粒体的这些特点对于研究动物遗传关系及起源进化十分有利[5]。很多研究者对贵德黑裘皮羊进行分子方面的研究[6-8]。其中，基于线粒体DNA的研究数量较少，且主要以线粒体D-loop区和Cytb基因为扩增对象，其他线粒体基因在贵德黑裘皮羊系统进化方面的研究应用较少[6,9]。近年来，研究发现羊线粒体DNA的COI基因含有的遗传物质具有很强的系统解析能力，主要用于属、种级系统发育的研究[10]。但还未有学者利用此基因对贵德黑裘皮羊进行系统发育分析。本研究基于线粒体COI基因对贵德黑裘皮羊进行系统发育分析，并探讨其与其他品种绵羊的遗传关系，为后续贵德黑裘皮羊的保种工作及资源合理利用提供参考。1材料与方法1.1样本采集本研究中使用的贵德黑裘皮羊样本来自西北民族大学生物医学研究中心的动物细胞保藏库，共选取样本5支，样本信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.002.T001表1样本信息Tab.1Sample information样本编号采样地点采样部位GD-1青海省卵巢GD-2青海省子宫GD-3青海省卵巢GD-4青海省卵巢GD-5青海省耳1.2基因组DNA的提取及DNA浓度检测使用常规方法将冻存细胞进行复苏培养后，采用通用型基因组DNA提取试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）对细胞进行基因组DNA的提取，使用Qubit 4对所提取的基因组DNA进行浓度检查。1.3引物与PCR扩增以Genbank中绵羊mtDNA（序列号为AF010406）全序列为基础，进行引物的设计。所设计的上游引物为COIF（5'-ACAGTCGGAATAGACGTCGA-3'），下游引物为COIR（5'-GGTTCTTCAAATGTGTGGTATGG-3'）。引物由宝生物工程（大连）公司合成。利用所设计的引物对贵德黑裘皮羊进行线粒体COI基因序列的扩增。试验前，通过不断的试验，建立最佳的PCR扩增体系，此次扩增体系（25 μL）：上下游引物为0.5 μL和10 μmol/L、DNA 2 μL、2×Pro Taq Master Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；最后72 ℃延伸10 min。将扩增产物用1.4%琼脂糖凝胶电泳，在136 V电压下跑胶30 min进行检测。检测合格的扩增产物送兰州天启基因生物科技有限公司测序。1.4数据统计与分析获得测序结果用Geneious 11.0.4处理原始测序文件，将2条序列的波峰进行拼接得到比较完整序列的波峰图，并对完整的样本序列波峰图进行校对，最终生成Fasta文件格式获得单个样本的完整序列。所得贵德黑裘皮羊COI基因序列与Genbank上已发表的其他绵羊品种的COI基因序列用MEGA-X处理，所用绵羊品种信息见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.002.T002表2Genbank上已发表的绵羊品种信息Tab.2Sheep breed information published on the Genbank品种名称序列号品种名称序列号西藏盘羊JX101654.1图申羊KF938343.1苏尼特羊KF938317.1马泽克羊KF938344.1岷县黑裘皮羊KF938318.1嘎拉羊KF938345.1乌珠穆沁羊KF938319.1库伊布斯科夫羊KF938346.1巴尔楚克羊KF938321.1普拉门卡羊KF938347.1和田羊KF938322.1卡拉库耳大尾羊KF938348.1坡羊KF938323.1斯温亚尔卡羊KF938349.1吐鲁番黑羊KF938324.1弗佐索卡羊KF938350.1青海藏羊KF938325.1卡拉柴羊KF938351.1策勒黑羊KF938326.1奥帕里诺羊KF938352.1呼伦贝尔羊KF938327.1凯努区格雷羊KF938353.1井中羊KF938328.1芬兰绵羊KF938355.1汉中羊KF938329.1维也纳绵羊KF938356.1巴什拜羊KF938330.1大角(山地)野羊KF938357.1巴音布鲁克羊KF938331.1库伦达羊KF938358.1多浪羊KF938332.1牛津羊KF938359.1哈萨克羊KF938333.1贾隆克羊KF977845.1吉尔吉斯羊KF938334.1萨赫勒羊KF977846.1兰州大尾羊KF938335.1阿勒泰羊KP981378.1滩羊KF938336.1甘肃藏羊KP981379.1塔什库尔干羊KF938337.1山东大尾羊KP981380.1叶城羊KF938338.1欧拉羊KT148968.1拜达拉克羊KF938339.1欧拉藏羊KU575248.1安迪转基因羊KF938340.1蒙古盘羊KX609626.1乌德穆尔特羊KF938341.1汉姆海姆达尼绵羊MF004244.1奥兰羊KF938342.1卡拉迪绵羊MF004246.1计算贵德黑裘皮羊种内及贵德黑裘皮羊与其他绵羊品种间的遗传距离，构建ML进化树、NJ进化树，并进行系统发育分析。选用p-disdtance作为模型构建NJ进化树进行遗传距离的计算。运用MEGA软件中的MODELS功能对构建ML进化树的最佳模型进行计算。通过计算，查看序列数据的BIC值（BIC值表示的是模型对数据的解释度，BIC值越小则表示模型对数据的解释力越强），并选取BIC值最低的模型作为最佳模型进行ML树的构建。2结果与分析2.1COI基因扩增测序结果将检测合格的PCR扩增产物送由兰州天启基因生物科技有限公司进行测序，测序结果显示扩增序列长度合适，为所扩增目标基因序列，经过序列拼接校对后得到的序列长度均为622 bp，整理后的结果仅发现GD-3样本在622 bp处发生单核苷酸变异，碱基A突变为碱基T，其他样本序列均未发生突变。2.2贵德黑裘皮羊基于COI基因系统发育分析利用MEGA将经Geneious11.0.4软件拼接校对后的贵德黑裘皮羊COI序列与在GenBank上下载的52个序列，用邻近法（见图1）和最大似然法（见图2）进行贵德黑裘皮羊系统发生树的构建。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.002.F001图1NJ系统发生树Fig.1Neighbor-joining phylogenetic treeXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.002.F002图2ML系统发生树Fig.2Maximum Likelihood phylogenetic tree由图1可知，基于COI基因用邻近法所构建的系统发生树可看出贵德黑裘皮羊品种之间，样本GD-1、GD-4、GD-5距离较近，样本GD-2和GD-3与其他3个样本距离较远，但都聚在同一支上。同时，试验选用的5个贵德黑裘皮羊样本个体COI基因序列与乌珠穆沁羊、滩羊、青海藏羊、塔什库尔干羊等18个品种的羊聚为一支，说明所试验贵德黑裘皮羊与这18个绵羊品种有较近的亲缘关系；也说明所采集到的贵德黑裘皮羊样本有可能与这18个亲缘关系较近的品种的羊存在基因流。结果显示，贵德黑裘皮羊与蒙古盘羊、西藏盘羊、芬兰绵羊等34个国际羊的品种没有聚在同一支上，有较远的亲缘关系。其中，亲缘关系最远的是蒙古盘羊、西藏盘羊。基于COI基因序列先运用MEGA软件中MODELS功能计算，找到构建最大似然法系统发生树的最佳模型Tamura 3-parameter，进而利用最大似然法所构建的系统发生树。由图2可知，结果与邻近法所建的系统发生树结果相差不大，显示贵德黑裘皮羊样本仍与乌珠穆沁羊、滩羊、青海藏羊等18个国际上的绵羊品种聚为一支，样本GD-2与样本GD-1、GD-4、GD-5距离较近，样本GD-3却与其他4个样本有一定差异，说明该样本与其他绵羊品种存在基因流，可能是品种间杂交导致。3讨论mtDNA在生物体内会随着线粒体独立复制，不受核基因影响，不与组蛋白结合而裸露，具有严格的母系遗传特点，且拷贝数远远高于核DNA。核基因会随着待检样本的变质腐蚀而降解，但样本仍可通过PCR扩增技术对mtDNA进行扩增检测，且与核基因相比，mtDNA扩增更容易[11]。mtDNA较核基因有较低的突变率，mtDNA在一些区段变异较快，而基于母系遗传的特点在另一区段可能相对保守。同时，母系遗传的特点使其不受外来杂交公畜基因的影响，并且保留好进化过程中的变异位点，能够在系统进化研究中更好地提供遗传材料[12]。近年来，研究发现mtDNA的COI基因含有的遗传物质具有很强的系统解析能力，适用于属、种间的遗传进化关系研究，有不少研究利用其进行物种遗传进化的研究并取得一定成果。徐浩文等[13]经过对8个地理种群红条毛肤石鳖COI基因进行扩增研究遗传多样性，得到南方与北方的红条毛肤石鳖群体遗传多样性存在差异，应该对2个地区的红条毛肤石鳖分别进行相对应的保护措施。赵庆等[14]利用COI基因分析我国重要的贝类之间的系统进化关系，研究表明，COI基因能对不同区域的同一种群进行聚类，验证COI基因在物种系统进化研究中的可行性。但是，目前尚未见到对贵德黑裘皮羊进行COI基因扩增研究其系统进化关系的报道。因此，本次试验经过反复试验，选取PCR最优反应体系对贵德黑裘皮羊线粒体DNA的COI基因进行扩增。因核苷酸序列数据属于性状数据，不能够通过核苷酸序列来研究物种的进化距离，所以得到的扩增结果经测序及Geneious11.0.4软件校对处理后需要用软件将核苷酸序列数据转化为种群个体之间的距离值，再进行分析[15]。本试验结果显示，贵德黑裘皮羊样本之间均聚为一支，但GD-3与其他样本GD-1、GD-2、GD-4、GD-5有一定的亲缘距离。同时，在参与系统进化树构建的GenBank上下载的52个品种羊中，与贵德黑裘皮羊聚为一支的共有18个品种，与贵德黑裘皮羊有较近的亲缘关系，可以初步判断所采集贵德黑裘皮羊样本有可能与国际上其他绵羊品种进行了杂交，且样本GD-3个体与其他亲缘关系相对较远品种的羊进行了杂交。其余34个国际上的绵羊品种都没有与贵德黑裘皮羊品种聚为一支，与贵德黑裘皮羊有较远的亲缘关系，其中亲缘关系较远的是蒙古盘羊和西藏盘羊。4结论本研究结果显示，贵德黑裘皮羊种质资源的保护应避免其与其他绵羊品种之间的基因流。未来研究工作应利用多基因、多手段的分析方法，系统、全面地揭示贵德黑裘皮羊种群遗传情况与系统进化关系，为其种质资源遗传保护提供可靠的参考依据。