庆阳驴是甘肃省庆阳市特产，农业农村部于2010年9月13日批准对“庆阳驴”实施农产品地理标志登记保护。驴肉的氨基酸含量丰富，包括人类所需的各种必需氨基酸。驴肉必需氨基酸含量高于牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉，且具有补血、补气、补虚的功能。驴皮质柔韧厚实，可用于制革，还具有药用价值，是名贵中药“阿胶”的原料。驴奶价值也很高，营养成分比例占人奶所含成分的99％，具有滋润皮肤、改善面部环境的作用。随着人们对药食同源保健品的认可度越来越高，驴产业发展迅速，驴副产品开始从古方药品逐渐走向百姓餐桌和日常生活。目前，关于驴的饲养管理[1-2]、生产性能[3-4]、屠宰性能[5]及肉质营养成分[6]等方面的研究较多，对庆阳驴的研究也大多集中于品种[7]、资源开发利用与保护现状和对策[8-13]，此外还有部分冷冻精液制作[14-15]等方面的研究。但对庆阳驴的精液品质分析和血液基本生化指标检测却未见报道。本文为充分了解庆阳驴的优良品种特性，在庆阳驴主产区开展了冷冻精液制作试验，同时采集庆阳驴血液进行生化指标检测，以期为实际生产中庆阳驴的健康养殖、兽医临床检验和诊断、品种遗传育种等提供参考。1材料与方法1.1试验动物试验选择庆阳驴（公驴5头、母驴8头），年龄3~4岁，体质健康，发育良好，精神状态良好。所有试验驴均来自庆阳市鑫禾牧业有限公司庆阳驴养殖基地。驴的饲养管理按照养殖基地的饲养管理技术规程进行，采用自由饮水、“三定”原则、“先粗后精”的饲喂方式，给予自然光照和安静、卫生的圈舍环境。1.2试验材料1.2.1试验仪器一次性无菌采血管、离心机、无菌EP管、ZM-103采精器械（采精筒、内胆、一次性采精内衬、不锈钢保温集精杯、集精杯固定套）、AXTGL 16M-Ⅱ离心机（上海赵迪实验室离心机）、移液枪（量程10 µL、5 mL）、电子秤、磁力搅拌器、水浴锅、高压灭菌锅、烘箱、冰箱、密度仪（minitube photometer SDM 1）、秒表、显微镜、恒温台、MCT-200低温温度计（北京市宇时技术开发公司）、精液冷冻架等。1.2.2试剂与耗材OPTIX cell 2稀释液（卡苏公司）、蒸馏水、凡士林、封口粉、高锰酸钾、生理盐水、液氮、进口过滤采精袋、烧杯、量筒、细管、泡沫箱、指型管、镊子、剪刀、水银温度计、保温瓶、无菌纱布、无菌纱布袋、载玻片、盖玻片、滤纸、玻璃棒、喷壶、毛巾、标签纸、记号笔等。1.3测定指标及方法1.3.1血清生化指标11只庆阳驴在空腹状态下，用一次性无菌采血针头进行前腔静脉采血，5 mL普通血清管收集血液，室温静置30 min，3 000 r/min离心10 min，取血清分装于1.5 mL无菌EP管中，带回实验室，-20 ℃保存，并及时将血清送至检测机构进行生化指标测定。使用全自动生化分析仪（BECKMAN COULTER AU5811）测定血清生化指标，每份血样重复测定3次，取平均值。测定血清生化指标包括：葡萄糖（GLU）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、白球比（A/G）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷草转氨酶/谷丙转氨酶（AST/ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基转移酶（GGT）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、总胆汁酸（TBA）、淀粉酶（AMYL）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。1.3.2精液品质5头种公驴在开始采精前先进行调教，“空采”两轮后使用，保证精液质量。每间隔3 d采精一次，使用消毒后的假阴道刺激法进行精液采集，通过进口过滤采精袋收集精液至集精杯中，称量体积（定义1 g≈1 mL），记录射精量。移液枪取5~7 μL原精，显微镜下观察精子状态，目测估计精子活力。使用精液密度测定仪（minitube photometer SDM 1）检测原精液中精子密度。根据精液的活力、密度对其进行预稀释，活力越高、密度越大预稀释倍数越大（1∶1~1∶6），水浴10 min，室温条件下1 850 r/min离心9 min，弃上清液。再加精液稀释液，确保最终稀释后精子密度≥3.5亿/mL，轻轻混匀，稀释后的精液分装到0.5 mL细管中，并用封口粉封口。细管的精液中间部分含有一段0.5 cm长的空气，用4层毛巾包裹放在4 ℃冰箱中平衡1 h（以0.01 ℃/s速度缓慢降温至4 ℃），并在此温度下进一步平衡2 h左右。采用液氮熏蒸冷冻法冷冻精液，并投入液氮中长期保存。每一批冷冻样品均进行解冻自检，估计其解冻后活力。上述指标每份样品均重复测定3次，取平均值。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2007软件进行初步整理，SPSS 19.0统计分析软件对精液各指标以及血清生化指标分别进行相关性分析、单因素方差分析和t检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1种公驴精液品质及冻后活力分析（见表1）由表1可知，种公驴平均采精量为66.90 mL，原精活力为0.67，原精密度为1.89亿/mL，平衡时间为2.63 h，平衡后活力0.53，解冻后活力0.37。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.012.T001表1种公驴精液品质及冻后活力分析Tab.1Analysis of semen quality and viability after freezing of breeding male donkey编号采精次数/次采精量/mL原精活力原精密度/(亿/mL)平衡时间/h平衡后活力解冻后活力平均值8066.90±32.720.67±0.051.89.±0.512.63±0.550.53±0.050.37±0.0611594.40±40.120.68±0.051.72±0.322.47±0.520.54±0.070.39±0.0721750.22±25.780.67±0.052.22±0.442.62±0.550.53±0.040.36±0.0631766.88±31.400.67±0.051.69±0.472.50±0.430.52±0.040.35±0.0441754.83±28.170.66±0.051.60±0.342.85±0.630.53±0.040.39±0.0551472.36±17.370.68±0.042.27±0.582.68±0.580.51±0.050.36±0.052.2采精量与精液各指标之间的相关性（见表2）由表2可知，采精量与原精液密度呈极显著正相关（P0.01），与平衡后活力呈显著正相关（P0.05）。原精活力、解冻后活力与平衡后活力呈显著正相关（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.012.T002表2采精量与精液各指标之间的相关性Tab.2Correlation between seminal quantity and semen index项目采精量原精活力原精密度平衡时间平衡后活力解冻后活力采精量1.000原精活力-0.1201.000原精密度0.443**0.0171.000平衡时间-0.249-0.1030.1491.000平衡后活力0.227*0.159*-0.1650.0351.000解冻后活力0.167-0.034-0.0920.1690.274*1.000注 ：*表示显著相关（P0.05），**表示极显著相关（P0.01）。2.3庆阳驴23项血清生化指标分析（见表3）由表3可知，庆阳驴所测定的23项血清生化指标中，除公驴血清CK外，其余22项指标的结果与参考值相符。公驴血清CK活性高于参考值，且显著高于母驴（P0.05）。公驴血清GLU、TP、ALB、A/G、ALT、AST、AST/ALT、LDH、CK、CREA、UREA、TG、HDL-C等指标均高于母驴，其中血清ALB和UREA含量极显著高于母驴（P0.01）；GLU含量、CK活性及A/G显著高于母驴（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.012.T003表3庆阳驴23项血清生化指标分析Tab.3Analysis of 23 serum biochemical indexes of Qingyang donkeys项目公驴母驴平均值参考范围[16]GLU/(mmol/L)5.05±0.30*4.36±0.42*4.67±0.504.20~5.70TP/(g/L)60.04±4.2356.75±3.1958.25±3.9056.00~79.00ALB/(g/L)31.88±2.12**26.13±3.10**28.75±3.9525.00~39.00GLB/(g/L)28.16±4.6130.62±1.5629.50±3.3724.00~47.00A/G1.16±0.27*0.87±0.14*1.00±0.25—TBIL/(μmol/L)3.50±1.524.80±0.964.21±1.360~60.00DBIL/(μmol/L)1.54±0.881.55±0.141.55±0.56—IBIL/(μmol/L)1.96±1.833.25±1.042.66±1.53—ALT/(U/L)6.00±0.825.33±0.585.71±0.765.00~50.00AST/(U/L)361.40±56.21321.33±46.04339.55±52.55100.00~600.00AST/ALT63.83±17.3360.64±9.3862.47±13.51—ALP/(U/L)188.40±34.25188.50±40.24188.45±35.7610.00~326.00GGT/(U/L)40.40±19.3752.00±16.2146.73±17.840~87.00LDH/(U/L)686.20±183.97672.50±90.81678.73±133.09250.00~2 070.00CK/(U/L)380.00±101.87*203.67±95.06*283.82±130.9510.00~350.00TBA/(μmol/L)4.36±0.84**6.75±0.93**5.66±1.51—AMYL/(U/L)5.50±1.006.00±1.005.71±0.950~35.00CREA/(μmol/L)107.40±15.1899.50±5.82103.09±11.2371.00~187.00UREA/(mmol/L)7.54±0.47**5.02±0.78**6.16±1.463.00~8.90TG/(mmol/L)0.69±0.150.68±0.110.69±0.120.13~0.76TC/(mmol/L)1.91±0.201.92±0.181.91±0.181.30~2.90HDL-C/(mmol/L)1.38±0.141.37±0.201.37±0.17—LDL-C/(mmol/L)0.31±0.01*0.37±0.04*0.34±0.04—注 ：*表示二者差异显著（P0.05），**表示二者差异极显著（P0.01）。母驴血清GLB、TBIL、DBIL、IBIL、ALP、GGT、TBA、AMYL、TC、LDL-C等10项指标均高于公驴，其中血清TBA含量极显著高于公驴（P0.01），LDL-C含量显著高于公驴（P0.05）。3讨论3.1庆阳驴种公驴精液品质精液品质是衡量种公畜繁殖性能的一项决定性的指标。家畜的射精量由高到低依次为：猪、马、牛、羊。驴的射精量与马大致相同，平均约60 mL。《庆阳地区畜牧志》记载，庆阳驴公驴适宜配种年龄为2.5~3.0岁，成年公驴平均射精量67 mL[17]。何良军等[18]研究表明，吐鲁番公驴的原精密度平均为1.9亿/mL，活力大多约0.6，解冻后活力约0.34。本研究采集庆阳驴的精液并开展冷冻精液制作试验，分别对其采精量、精液密度、原精活力、平衡后活力、平衡时间、解冻后活力等进行检测分析，结果显示，庆阳驴平均采精量为66.90 mL，原精活力为0.67，原精密度为1.89亿/mL，平衡时间为2.63 h，平衡后活力0.53，解冻后活力0.37，与前人研究结论基本一致。但也有研究显示，德州驴采精量为45~60 mL，密度在2.8亿/mL以上，原精活力在0.85以上，解冻后活力在0.40以上[19-21]。结果与本研究存在较大差异，主要原因可能是试验中精液的活力主要依据目测，完全依靠试验人员经验，且驴的品种也不同。此外，也不排除采集精液过程中造成的影响。精液解冻后活力低也与冷冻和解冻过程息息相关，本试验与前人试验在精液处理过程中所用的稀释液不同，且本试验采用人工熏蒸法制作冷冻，对时间和温度控制的稳定性不如程序冷冻仪。3.2庆阳驴精液品质指标间的相关性相关分析是研究变量之间相互依存关系的密切程度及其相关方向。通过分析可知，种公驴采精量与原精液密度呈极显著正相关，与平衡后活力呈显著正相性。此外，原精活力、解冻后活力与平衡后活力均呈显著正相关，表明在整个采精量过程中，前期所收集的主要为精清，中后期所收集到的精液中精子含量较多。因此，采精人员采集精液过程中应注意方法，确保收集到质量较高部分，防止种公驴射精不完全。采集的精液较多，其中维持精子存活的营养物质等成分越丰富，对于精子保持较高活力作用也越大，因而在稀释、离心、平衡后精子仍可保持较好的活力。在相同条件下，精子原精活力越高，经同样处理之后精子平衡后活力也越高；精子平衡后活力越高，其在熏蒸冷冻处理过程中耐受力越强，冷冻精子解冻再复苏后活力亦越高。3.3庆阳驴血清生化指标血液是动物机体主要的流动运输系统，具有营养组织、调节器官活动和防御有害物质的功能，尤其对维持机体内环境稳定具有重要意义。血清生化指标是反映动物内环境稳态的核心参数，是反映动物机体新陈代谢、生理状态和健康状况的重要指标，也是畜牧养殖中疾病诊断及监控的重要参考指标[22]。此外，各项血清生理生化指标不仅受到动物性别、年龄、生活环境及营养水平的影响，还会受到测定方法以及动物采食、运动、应激等多方面因素的影响。本试验结果显示，除公驴血清CK外，其余22项指标结果与参考值相符，表明试验驴的机体代谢、生理状态和健康状况均良好。CK也称为肌酸磷酸激酶，广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，参与ATP的合成代谢，与肌肉收缩、神经功能、细胞的能量反馈调节及有氧耐力有关，运动后骨骼肌超微结构改变可导致血清CK活性升高。本试验中公驴血清CK活性略高于正常值，且显著高于母驴，原因可能是种公驴饲养空间大，运动量较充足，骨骼发育较好，与邹明等[23]报道贵州白山羊的结果一致。TP可分为ALB和GLB两类，其含量能够反映机体对日粮蛋白质的消化利用率。TP含量高则蛋白沉积增多，动物生长发育加快。在体液中，血清ALB可运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多功能因子等，还可维持血液正常的渗透压。本试验中，公驴血清TP含量高于母驴，且ALB含量极显著高于母驴，表明公驴体液中物质吸收及运输的功效较强，饲料转化率高，蛋白质沉积大于母驴。UREA是氨基酸代谢的主要终产物，CREA由肌酸形成，二者均是评估肾脏功能的指标。本试验中，公驴血清UREA含量极显著高于母驴，但均在正常值范围内，表明试验驴的肾脏功能无异常，但公驴氨基酸代谢比母驴快。GLU是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。在相关因素的调控下，血清GLU含量相对稳定，但在强烈的应激条件下可导致其升高或降低[24]。本试验中，公驴血清GLU含量高于母驴，究其原因可能是公驴的代谢、激素分泌等比母驴迅速。ALT和AST是机体两种重要的转氨酶，能够加快蛋白质合成代谢，增进机体对营养物质的转化效率，利于机体生长，若两种酶异常增多则表示出现肝损伤引起肝功能降低。LDH在肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中含量最多，是机体能量代谢重要酶。GGT是一种含巯基的线粒体酶，也是一种还原型谷胱甘肽代谢酶。GGT与细胞内还原型谷胱甘肽的合成有关，是谷氨酰循环中的关键酶，血清GGT主要来自肝脏[25]。ALT主要来自骨骼，由成骨细胞分泌，经胆道系统排泄，其含量与心肝生理功能及骨骼发育密切相关[23]。TBIL是一种由脾内巨噬细胞降解血红蛋白产生的不溶性分子，可判断黄疸的病因、评估肝功能和检查胆管通畅程度。胆汁酸促进脂肪的吸收，通过胆汁酸合成调节胆固醇水平，任何损伤肝细胞、胆道或胆汁酸门脉肠肝循环的病变均可导致血清胆汁酸浓度升高。TC和TG是反映身体脂质代谢的重要指标，与能量代谢密切相关[26]。低密度脂蛋白从肝脏转运出胆固醇和甘油三酯，进入血液，供细胞利用；高密度脂蛋白则将胆固醇从身体组织运输到肝脏。AMYL主要来自胰腺，血清AMYL活性升高通常由胰腺疾病造成。本试验中，庆阳驴的上述血清生化指标结果均在参考值范围内，且不同性别间差异不显著，表明其肝胆系统、肾功能、胰腺分泌功能均正常，也表明了性别因子对血清生化指标的影响甚微，成年庆阳驴的血清生化指标具有相对稳定性。4结论本试验通过开展庆阳驴冷冻精液制作分析精液品质，且较完整地检测庆阳驴在健康状态下血清生化指标，利于维持和发展庆阳地区庆阳驴的个体选择与选配，同时有助于动物管理者对庆阳驴进行更加准确的健康评估、疾病诊断及监控，以促进种质资源保护和利用。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.012.F001