精确控制器官大小是后生动物的一个关键特征，也是动物发育和再生的关键过程[1]。过去十年的发育遗传学研究表明，功能器官的大小是细胞数量和（或）细胞大小调节的结果，通常通过协调细胞生长、增殖和凋亡实现[2]，主要受到环境因素和细胞内在机制的影响。河马（Hippo）信号通路是近年来发现最重要的细胞应激信号通路之一，最早在果蝇中被发现，是一种抑制细胞生长的信号通路。Hippo信号通过参与调节组织生长和器官大小[3]，在昆虫、人类等各种物种中起到重要作用。Yorkie（Yki）作为一种转录辅助激活因子，在Hippo信号通路的下游起到最关键的效应器作用[4]，对机体器官大小的控制具有重要作用。在昆虫中，Yki的过度表达会导致细胞增殖增加和凋亡停滞；对家蚕Yki进行RNA干扰或过度表达会对家蚕变态产生影响，可促进昆虫适时变态[5]。意大利蜜蜂是自然界重要的授粉昆虫，也是一种变态发育的重要经济昆虫，目前是我国主要饲养的蜂种。作为社会性昆虫，蜂王、工蜂和雄蜂的发育阶段也因品级差异而有所不同，但目前关于意大利蜜蜂不同发育时期内生长发育的调控机制尚不清楚。因此，开展关于意大利蜜蜂控制器官大小及与变态相关的Hippo信号通路的关键基因amYki的研究，对深入了解意大利蜜蜂的生长发育调控机制具有重要意义。本研究通过对3种品级的意大利蜜蜂在不同发育阶段amYki基因表达谱进行检测，以期为进一步探讨amYki在意大利蜜蜂生长与发育过程中的生理功能提供参考。1材料与方法1.1试验动物本试验所用意大利蜜蜂均采自甘肃省兰州市五泉王氏养蜂场，采样如下：3种品级（工蜂、雄蜂、蜂王）各取第2出生日龄的卵（YKI-G-2、YKI-X-2、YKI-W-2），第3出生日龄的孵化期幼虫（YKI-G-3、YKI-X-3、YKI-W-3），蛹期的预蛹、白眼蛹、红眼蛹和羽化成虫（YKI-G-Y、YKI-X-Y、YKI-W-Y、YKI-G-B、YKI-X-B、YKI-W-B、YKI-G-H、YKI-X-H、YKI-W-H、YKI-G-C、YKI-X-C、YKI-W-C）。幼虫期工蜂取第5、第7、第9、第11出生日龄的幼虫（YKI-G-5、YKI-G-7、YKI-G-9、YKI-G-11），雄蜂取第4、第6、第8、第10、第12出生日龄的幼虫（YKI-X-4、YKI-X-6、YKI-X-8、YKI-X-10、YKI-X-12），蜂王取第4、第5、第6、第7出生日龄的幼虫（YKI-W-4、YKI-W-5、YKI-W-6、YKI-W-7）。1.2试剂与仪器Trizol、反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ均购自Takara公司；引物由上海生工股份有限公司合成[6-9]；使用伯乐荧光定量PCR仪进行qPCR检测。1.3试验方法使用Trizol法提取3个品级意大利蜜蜂各个发育阶段样品的总RNA[10]，用分光光度仪（Nanodrop2000）检测RNA浓度及纯度，使用试剂盒进行反转录。根据GenBank中意大利蜜蜂amYki（XM_026443161.1）序列，利用NCBI在线网站设计qPCR引物，由上海生工股份有限公司合成，引物序列见表1。以amβ-actin（NM_001185146.1）为内参基因，使用伯乐荧光定量PCR仪（Bio-Rad）进行qPCR检测。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.002.T001表1荧光定量PCR引物序列Tab.1Fluorescence quantitative PCR primer sequences基因名称引物序列(5'→3')引物长度/bpamYkiF：ACTTCCTCAACCACCTGACG20R：TCGGGCAATGGACCTAGAGA20amβ-actinF：TGCCAACACTGTCCTTTCTG20R：AGAATTGACCCACCAATCCA20将反转录得到的cDNA样品作为模板，每个模板设置3个生物学重复。每个复孔的总体系（20 μL）：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL、无Rnase H2O 6.4 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；95 ℃延伸15 s，55 ℃退火1 min，95 ℃延伸15 s[7-8]。1.4数据统计与分析根据2-ΔΔCt法计算相对表达量，采用SPSS Statistics 25软件对试验数据进行单因素方差分析[8]，Duncan's法进行多重比较，GraphPad Prism 9软件进行绘图。P0.05表示差异显著。2结果与分析RT-qPCR检测3个品级的意大利蜜蜂在不同生长发育时期amYki基因的表达水平，结果见图1~图3。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.002.F001图1amYki基因在工蜂各个发育阶段中的表达情况Fig.1Expression of amYki gene in various developmental stages of worker bee注 ： 不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.002.F002图2amYki基因在雄蜂各个发育阶段中的表达情况Fig.2Expression of amYki gene in various developmental stages of droneXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.002.F003图3amYki基因在蜂王各个发育阶段中的表达情况Fig.3Expression of amYki gene iin various developmental stages of queen bee由图1~图3可知，amYki基因在3个品级的意大利蜜蜂各个发育阶段均有表达并且存在显著差异（P0.05）。由图1可知，在工蜂的各个发育期中，卵前期与红眼蛹期amYki基因的表达率最低（P0.05），幼虫期11出生日龄的表达率最大（P0.05）。从卵期2出生日龄到幼虫期11出生日龄，amYki的表达率呈波浪式增加；从幼虫期11出生日龄到成虫期，amYki表达率呈波浪式减少。虫卵期2出生日龄与红眼蛹期的表达量差异不显著（P0.05），卵期3出生日龄与预蛹期表达量差异不显著（P0.05）。由图2可知，在雄蜂生长发育的不同时间中，红眼蛹期和羽化成虫时期amYki基因的表达率最低（P0.05）。8出生日龄幼虫和12出生日龄幼虫amYki表达率差异不显著（P0.05），但显著高于其他阶段（P0.05）。从2出生日龄卵到8出生日龄幼虫，amYki的表达率逐步增加；从12出生日龄的幼虫到羽化成虫期，amYki表达率呈波浪式下降。3出生日龄的孵化幼虫和4出生日龄幼虫表达量差异不显著（P0.05）。由图3可知，在蜂王生长发育的不同时间中，2出生日龄卵期和红眼蛹期的amYki基因表达量差异不显著（P0.05），且显著低于其他阶段（P0.05），以预蛹期的表达量最高（P0.05）。amYki表达率从4出生日龄幼虫到预蛹期逐渐增加，从预蛹期到红眼蛹期表达率逐步下降。幼虫期5出生日龄与成虫时期的表达量差异不显著（P0.05）。通过对意大利蜜蜂3个品级不同发育时期amYki基因表达情况进行对比分析，结果表明，3个品级的意大利蜜蜂从卵期到孵化期间，从幼虫期第1到最后1 d，amYki表达量均逐渐增加；从白眼蛹期到红眼蛹期再到成虫，3个品级该基因的表达量变化趋势一致，均为先降低后升高。3讨论在机体生长发育过程中，细胞增殖和凋亡之间的协调对器官大小的控制至关重要，这一过程主要由Hippo信号通路的下游转录辅激活因子Yki调控。Hippo信号通路的核心成员包括Hpo、Sav、Wts和Mats，主要下游效应器是转录辅激活子Yki[11]。由Hippo信号通路的核心成员形成激酶级联调控网，并调节下游靶蛋白的活性，其中Hpo和Sav形成复合物，通过磷酸化激活Wts和Mats结合，之后使Yki磷酸化并失活[2]。一般Hippo通路的功能是抑制Yki的下游效应器，当Hippo通路被抑制时，Yki会转移到细胞核，并通过序列特异性DNA结合位点与Scalloped（Sd）结合，以增强与细胞增殖相关基因的表达。哺乳动物中Hippo通路保守，若该通路异常，细胞增殖将无法控制，从而导致人类癌症[12]。目前，关于Yki在昆虫中的研究主要集中于哺乳动物肿瘤细胞及果蝇肿瘤细胞、上皮组织等方面，关于蜜蜂生长发育方面的研究鲜见报道。Gangwani等[13]研究表明，果蝇Tep1基因通过进化保守机制调节Yki。Tep1下调导致Yki活性降低及抑制神经胶质瘤生长，确定了Tep1-Yki在幼体中枢神经系统中的相互作用，在神经胶质瘤的生长和进展中起到关键作用。Zhang等[14]研究发现，当器官原基和区域身份域被指定时，Yki通路在发育中的果蝇眼盘上皮组织中起到主要作用，表明在果蝇E2F1和Sd之间的相互作用破坏了Yki/Sd复合物的形成，从而抑制了Yki靶基因的表达[15]。RBF可通过减少E2F1/Sd相互作用改变这些效应。Yki在果蝇中的过度表达导致细胞增殖增加、凋亡减少和组织过度生长[4]。Yki基因敲除也可加速棉铃虫中肠细胞的凋亡和变态[16]。在德国小蠊中，Yki调节卵巢细胞的物种形成、迁移和增殖[17]。此外，Yki可以通过控制双斑蟋原始细胞的增殖，调节腿部的大小和形状[18]。Yki还参与家蚕的发育过程，在家蚕蛹前期，RNA干扰Yki的表达延迟了桑蚕发育和卵巢成熟，使用杆状病毒介导过表达可加速5龄幼虫器官生长和变态[5]。综上所述，这种调节对细胞凋亡、器官大小和原始细胞增殖具有显著影响，然而Yki在蜜蜂中鲜有相关研究报道。本研究通过RT-qPCR方法检测了3个品级意大利蜜蜂在不同发育时期amYki基因的表达情况。结果发现，3个品级的意大利蜜蜂的不同发育阶段中均有amYki基因表达，表明Yki在意大利蜜蜂各个发育阶段均存在。Yki在鳞翅目昆虫家蚕的不同龄期也呈特异性表达[19]，表明amYki可能在意大利蜜蜂生长发育中发挥重要作用。在家蚕中，胚胎期BmYki的表达逐渐增加时，组织和器官处于快速发育状态[20]。本研究中，3个品级的蜜蜂从卵期到孵化期以及从幼虫期第1 d到幼虫期最后1 d的amYki基因表达量快速上升，表达量变化规律与发育情况相吻合。Piulachs等[19]研究表明，家蚕BmYki的表达量在产卵后12 h快速升高，在产卵后18 h达到峰值，结论与本研究相似，由此可推测Yki基因可能与昆虫幼虫的生长发育相关。预蛹期的工蜂和雄蜂较幼虫最后1 d amYki基因表达量下降，而此时蜂王amYki基因的表达量仍处于上升状态，因为蜂王的发育过程历经时间短于工蜂和雄蜂，这种现象可能与蜂王机体迅速发育的需求相关。4结论本研究结果表明，3种品级意大利蜜蜂的amYki基因表达变化趋势与发育阶段变化规律趋于一致，可见在意大利蜜蜂的生长发育过程中，amYki基因起到重要作用。