沙门氏菌可引起鸡白痢、禽伤寒和鸡输卵管感染，甚至导致死亡[1]。鸡感染沙门氏菌常呈慢性或隐性感染，带菌率高[2]。鸡感染大肠杆菌常出现败血症、心包炎、肉芽肿、气囊炎、肝周炎、肿头综合征、脑炎、输卵管炎、眼炎等[3]。空肠弯曲杆菌常引起鸡腺胃、肌胃和肠黏膜出血、水肿，肝脏肿大坏死，肾肿大[4]。鸡感染奇异变形杆菌后可引起腹泻、神经症状及脑膜、法氏囊、肾脏、脾脏肿大出血等症状。上述4种存在于鸡粪中的细菌可在较长时间内维持其感染性，通过鸡粪传播使鸡群感染、发病，降低机体免疫力，增加继发其他疾病的概率[5]。4种常见致病菌感染在临床上较难区分，且往往存在混合感染，但目前为止尚未见这4种病原菌多重定量PCR检测方法的研究报道。本试验在现有上述4种致病菌单一定量PCR的基础上，建立4种致病菌SYBR Green Ⅰ多重定量PCR检测方法，以期为临床快速、简便地检测鸡大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌单一或混合感染提供参考。1材料与方法1.1试验材料大肠杆菌（ATCC-25922）、肠炎沙门氏菌（ATCC-13076）、金黄色葡萄球菌（CCMCC-1.0128）购自中国微生物菌种保存中心。空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、巴氏杆菌、志贺氏菌、链球菌均由河北工程大学动物医学重点实验室分离鉴定并保存。定量PCR仪购自耶拿分析仪器有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。1.2引物设计使用王艳萍等[6]设计的大肠杆菌特异性引物，扩增片段的大小为261 bp；使用本实验室刘东海设计的沙门氏菌特异性引物，扩增片段大小为411 bp；使用由冯育芳等[7]设计的空肠弯曲杆菌引物，扩增片段的大小为73 bp；使用李慧芳[8]设计的奇异变形杆菌特异性引物，扩增片段大小为395 bp。上述引物均由华大基因(北京)有限公司合成，引物信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.T001表1多重PCR检测引物信息Tab.1Primer information for multiplex PCR detection细菌名称引物名称引物序列（5'→3'）引物长度/bp大肠杆菌irp2-P1GCTCTGTGCCCTTTGA261irp2-P2GGCGGGAGGAGTAGTT沙门氏菌invA-FCTGGTTTTAGGTTTGGCGGC411invA-RCAAAGGTGACGCTATTGCCG奇异变形杆菌qrrA-FTTTATCAAAGCCTCAAACCC395qs4-RTGCGTCACCCTCTAACTCATC空肠弯曲杆菌aicsxii-FCACATTAAATCTTTATTTTCAACCCGCTGAA73aicsxii-RACAATCCATCTTCTATCATTGCCTTAGC反应体系（25 μL）：SYBR GreenⅠ Universal Master Mix 各12.5 μL、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌及大肠杆菌上下引物各0.8 μL、沙门氏菌上下引物各0.6 μL、4种细菌DNA模板各 1 μL，加ddH2O补足至25 μL。反应条件：95 ℃预变性8 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃ 延伸28 s，共40个循环；于4 ℃终止反应。1.3试验方法1.3.1标准曲线绘制将沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌和大肠杆菌培养后充分混匀，调整菌液浓度分别为8.9×107、7.8×106、3.8×107、5.6×106 CFU/mL。用ddH2O分别对沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌及大肠杆菌菌液进行10倍倍比稀释，水煮法提取各浓度菌液DNA，用优化后的反应条件进行SYBR Green Ⅰ定量PCR扩增，根据Ct值和稀释倍数绘制标准曲线。1.3.2灵敏度试验将沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌及大肠杆菌DNA以1×100～1×107共8个稀释梯度作为模板，用优化后的反应条件进行定量PCR扩增，根据所得扩增曲线，获得最低检测浓度。1.3.3特异性试验以粪肠球菌、屎肠球菌、巴氏杆菌、志贺氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌为对照菌，分别设沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌及大肠杆菌的DNA为阳性对照，以ddH2O为阴性对照，进行SYBR Green Ⅰ定量PCR扩增，检测该方法特异性。1.3.4重复性试验沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌及大肠杆菌的DNA进行10倍倍比稀释后各选取2个浓度，同一浓度各做3次SYBR Green Ⅰ定量PCR反应扩增，根据出现Ct值、Tm值，分别计算其组内变异系数，验证重复性。1.3.5临床样品检测取本实验室已经过16S rRNA鉴定保存的鸡肝脏、肾脏和盲肠阳性样品共34份，水煮法提取鸡肝脏、肾脏和盲肠的全基因组DNA，用建立的大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌和空肠弯曲杆菌SYBR GreenⅠ多重定量 PCR方法检测；同时人工混合4种细菌阳性样品作为阳性对照。通过溶解曲线及Tm值，确定4种细菌阳性结果，并与16S rRNA鉴定结果对比，确定该方法准确性。2结果与分析2.14种细菌标准曲线的建立（见图1、图2）由图1、图2可知，空肠弯曲杆菌熔解温度在79.2~79.6 ℃，收集荧光信号，形成单一波峰；浓度范围在7.8×101~7.8×106 CFU/mL呈一定的线性关系，拟合回归曲线y=-2.637 1x+37.717，R2=0.981。奇异变形杆菌熔解温度在81.8~82.1 ℃，收集荧光信号，形成单一波峰；浓度范围在3.8×102~3.8×107 CFU/mL呈一定的线性关系，拟合回归曲线y=-3.269 1x+41.961，R2=0.994 2。沙门氏菌熔解温度在84.3~84.6 ℃，收集荧光信号，形成单一波峰；浓度范围在8.9×101~8.9×107 CFU/mL呈一定的线性关系，拟合回归曲线y=-3.670 4x+40.383，R2=0.998 5。大肠杆菌熔解温度在89.7~90.2 ℃，收集荧光信号，形成单一波峰；浓度范围在5.6×102~5.6×107 CFU/mL呈一定的线性关系，拟合回归曲线y=-2.690 9x+ 40.382，R2=0.998 5。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F001图14种细菌SYBR Green I荧光定量PCR熔解曲线Fig.1SYBR Green I fluorescence quantitative PCR melting curves of four bacteria注 ： 溶解曲线从左到右依次为空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌。图24种细菌标准曲线Fig.2Standard curves of four bacteriaXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F2a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F2a2XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F2a3XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F2a42.24种细菌SYBR Green I 荧光定量PCR敏感性检测扩增曲线（见图3）由图3可知，空肠弯曲杆菌最低检测浓度为7.8×100 CFU/mL；大肠杆菌最低检测浓度为5.6×101 CFU/mL；奇异变形杆菌最低检测浓度为3.8×101 CFU/mL；沙门氏菌最低检测浓度为8.9×100 CFU/mL。图34种细菌SYBR Green I 荧光定量 PCR敏感性检测扩增曲线Fig.3Amplification curves of four bacteria detected by SYBR Green Ⅰ fluorescent quantitative PCRXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F3a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F3a2XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F3a3XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F3a42.34种细菌SYBR Green I荧光定量PCR特异性熔解曲线（见图4）由图4可知，溶解曲线从左到右依次为空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌的定量PCR反应熔解曲线，Tm值分别为79.4、81.9、84.4和90.0 ℃。4种细菌Tm值差异明显，可准确区分4种菌株。参考菌株和ddH2O均无波峰形成。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F004图44种细菌SYBR Green I荧光定量PCR特异性熔解曲线Fig.4SYBR Green I fluorescence quantitative PCR specific melting curve of four bacteria2.44种细菌重复性检测结果（见图5、表2、表3）由图5可知，空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌同一浓度梯度3个重复中，扩增曲线和熔解曲线均基本一致。图54种细菌 SYBR Green I 荧光定量PCR重复性检测扩增曲线与熔解曲线Fig.5Amplification and melting curves of four bacteria detected by SYBR Green I quantitative PCRXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F5a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.F5a2由表2、表3可知，空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌同一浓度梯度3个重复中，4种细菌Ct值组间变异系数分别为1.30%~1.96%、1.83%~2.22%、1.41%~2.22%、0.52%~0.88%；其Tm值分别为在79.2~79.6 ℃、81.8~82.1 ℃、84.3~84.6 ℃、89.7~90.1 ℃，Tm值的组间变异系数分别在0.16%~0.21%、0.11%~0.15%、0.10%~0.17%、0.11%~0.14%之间，其组间变异系数均小于1%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.T002表24种细菌Ct值标准差和变异系数Tab.2Standard deviation and coefficient of variation of Ct values of the four bacteria项目稀释浓度/(CFU/mL)Ct值标准差变异系数/％1st2nd3rd沙门氏菌8.9×10716.0115.1715.490.3462.228.9×10522.1822.6521.890.3131.41奇异变形杆菌3.8×10717.3217.6218.210.3692.083.8×10523.4524.4924.220.4401.83空肠弯曲杆菌7.8×10619.2418.7519.310.2491.307.8×10426.5826.4225.420.5131.96大肠杆菌5.6×10427.4127.5427.760.1440.525.6×10330.6431.1330.50.2700.88XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.T003表34种细菌Tm值标准差和变异系数Tab.3Standard deviation and coefficient of variation of Tm values of the four bacteria项目稀释浓度/(CFU/mL)Tm值标准差变异系数/％1st2nd3rd沙门氏菌8.9×10784.384.384.60.1410.178.9×10584.384.584.40.0820.10奇异变形杆菌3.8×10781.882.082.10.1250.153.8×10581.982.181.90.0920.11空肠弯曲杆菌7.8×10679.579.679.20.1700.217.8×10479.379.579.20.1250.16大肠杆菌5.6×10489.889.989.70.1250.145.6×10389.889.689.60.0940.112.5临床样品检测结果（见表4）由表4可知，采用研究建立的多重荧光定量PCR对临床34份阳性样品进行检测，共检出大肠杆菌17份、沙门氏菌25份、奇异变形杆菌6份、空肠弯曲杆菌3份；大肠杆菌和沙门氏菌混合感染10份、大肠杆菌与奇异变形杆菌混合感染1份、沙门氏菌与奇异变形杆菌混合感染3份、沙门氏菌与空肠弯曲杆菌混合感染3份。检测结果与16S rRNA鉴定结果符合率100％，表明所建立的大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌和空肠弯曲杆菌SYBR GreenⅠ多重定量PCR方法可应用于临床检测。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.001.T004表4临床样品检测结果Tab.4Clinical sample test results项目多重荧光定量PCR16S rRNA测序阳性符合率/％样品数/份阳性数/份阳性率/％样品数/份阳性数/份阳性率/％大肠杆菌341750.0341750.0100沙门氏菌342573.5342573.5100奇异变形杆菌34617.634617.6100空肠弯曲杆菌3438.83438.8100大肠杆菌+沙门氏菌341029.4341029.4100大肠杆菌+奇异变形杆菌3412.93412.9100沙门氏菌+奇异变形杆菌3438.83438.8100沙门氏菌+空肠弯曲杆菌3438.83438.81003讨论大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌和空肠弯曲杆菌均是鸡场中常见致病菌，鸡单独感染大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌和空肠弯曲杆菌后临床症状相似，依靠临床诊断不易区分、确诊[9-10]。临床中上述4种细菌性致病菌也常出现混合感染；近年来，鸡大肠杆菌病和沙门氏菌病混合感染日趋严重[11]，鸡沙门氏菌和奇异变形杆菌混合感染时有发生[12]，而空肠弯曲杆菌常与大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌混合感染[12]导致发病鸡群的病死率也呈增高趋势。同时，大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌是鸡主要垂直传染病，空肠弯曲杆菌可能通过侵入鸡蛋造成垂直传播[13]。由此可见，上述4类细菌性传染病一旦感染，将对养鸡业造成巨大损失。此外，大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌和空肠弯曲杆菌也可通过鸡肉、鸡蛋、鸡粪等被人类食用或经接触后感染给人[8,14-15]，导致人畜共患病发生。因此，建立高效、快速、准确同时检测这4类病原菌的方法，提高临床检测能力，提早规避疾病风险，对鸡场生物安全和公共卫生均具有重要意义。在国内，王艳萍等[6]建立了检测大肠杆菌SYBR Green Ⅰ定量PCR方法，耿蕊等[16]建立了检测沙门氏菌SYBR Green Ⅰ定量PCR方法，阳成波等[17]建立检测空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ定量PCR方法，史瑞雅等[18]建立了检测奇异变形杆菌SYBR Green Ⅰ定量PCR方法。但上述SYBR Green Ⅰ定量PCR方法只能检测一种病原菌。鉴于养殖过程中多种病原菌混合感染的情况日益增多，单一PCR技术诊断方法已难以满足临床诊断需要，而多重定量PCR检测技术日趋成熟，具有成本低、耗时短、敏感性高、特异性强、多种病原菌同步检测等优点，已被广泛应用于兽医微生物及食源性病原微生物的检测[19-20]。本试验基于现有检测大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌和空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ单一定量PCR的基础上，对反应体系、退火温度等条件进行优化，建立了SYBR Green Ⅰ多重定量PCR检测方法，可同时检测大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌和空肠弯曲杆菌感染。4种细菌的最低检测浓度分别为5.6×101、8.9×100、3.8×101、7.8×100 CFU/mL，结果表明该方法敏感性强。在试验过程中选取其他7种禽类常见致病菌作为对照菌，结果显示，对照菌无特异性扩增，表明该方法特异性好。对建立的SYBR GreenⅠ多重定量PCR方法进行重复性检验，大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌和空肠弯曲杆菌熔解曲线的Tm值分别在89.7~90.2 ℃、84.3~84.6 ℃、81.8~82.1 ℃、79.2~79.6 ℃，熔解曲线Tm值的范围较小，4种菌同一浓度重复性试验的变异系数也较小。4结论本试验建立的大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌和空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ多重定量PCR方法具有稳定性强、重复性好、敏感性高、特异性强等优点，且菌种间互相无干扰，操作简单、省时省力、节约成本，可直接应用于鸡场中病原菌的检测、筛查，防患于未然，也可应用于鸡大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌和空肠弯曲杆菌等4种常见病原菌的单一或混合感染的快速诊断。综上所述，本方法在畜禽养殖和实验室诊断方面具有较高的应用价值和推广前景。