羊痘是由羊痘病毒引起的一类急性、热性、高度接触性传染病[1-2]，也称“羊天花”，是最严重的动物痘病毒病，发病率达80%[3-4]。羊痘起源于中亚，后传播到西方多国。我国多地均有该病流行，尤其西北五省有时呈暴发流行[5-6]。患病羊主要症状是体温升高，皮肤无毛或少毛处产生特异的痘疹。痘初期为丘疹，后变成小水疱，之后变成脓疱，脓疱干燥结成红痂，脱落后治愈[7-8]。注射羊痘病毒弱毒疫苗可较好地控制该病流行。羊痘病毒属基因组为双股DNA，呈线形，全长约150 kbp，编码147ORFs。羊痘病毒基因组包括一个中心区（ORF024~ORF123）和两个末端侧翼区（ORF1~ORF23和ORF124~ORF147/156），前者主要是体现病毒在转录、RNA修饰以及病毒DNA复制等过程中发挥重要作用的角色，后者则是编码与病毒毒力和宿主范围等功能相关的蛋白。转录因子也是一个调节蛋白质，转录因子一般由DNA结合和基因控制区段、寡聚化位点和核位置信息区段等四大主要功能域组成[9]，通过特异序列组成的DNA结合作用域与下游调节转录基因的开启子融合，参加生命体中各种生理生化通路的调节[10]。羊痘病毒中有4个转录因子，晚转录因子VLTF-3是ORF088编码的蛋白，属于病毒基因组的中心区。本研究构建晚转录因子VLTF-3原核表达载体及结构功能预测，探究羊痘病毒晚转录因子VLTF-3在病毒转录中的致病机制及其生物学特性、功能，为今后山羊痘病毒致病机制的研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料羊痘病毒Thx毒株来自新疆南疆某地山羊痘病羊组织病料，保藏于塔里木大学畜牧科技重点实验室。DH5α、BL21感受态细胞由新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室制备，于-80 ℃保存。1.2试验试剂琼脂糖凝胶电泳DNA回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、琼脂粉（北京天根生物工程技术服务有限公司），酶切纯化试剂盒（OMEGA公司），Primestar聚合酶（大连宝生物科技公司），PCR Mix酶（庄盟生物科技公司），Nde I、Xho I等限制性内切酶、dNTPs（Thermo生物科技公司），T4连接酶（promega公司）。1.3试验设备TC-5000梯度PCR机（TECHNE公司）、琼脂糖水平电泳仪（北京市六一公司）、隔水式恒温培养箱（上海市一恒科研仪器设备股份有限公司）、凝胶成像控制系统（Bio-Rad公司）、小型台式高速离心机（eppendorf公司）、SWCJ-2FD超净工作台（BXOXUN公司）、XMTP-204三温三控水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。1.4试验方法1.4.1引物合成根据GenBank中的羊痘病毒Pellor株（登录号：NC-004003.1）基因序列设计VLTF-3的特异引物，为方便后期克隆，在其上下游引物的5'端增加了Nde Ι、EcoR Ι限制性内切酶切位点，引物由武汉市天一辉远有限公司合成。引物信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.T001表1引物信息Tab.1Primer information引物名称引物序列(5'→3')片段大小/bpGTPV-088 P1GGAATTCCATATGAATTTAAATTTAAAAATG681GTPV-088 P2CCGCTCGAGTATATCTAAAGAACAAG注 ：画线部分分别为Nde Ι、EcoR Ι酶切位点。1.4.2目的基因PCR扩增以含有羊痘病毒的目的基因为模板，采用Primestar聚合酶扩增(100 μL)：模板8 μL、上下游引物各2.8 μL、Prime star酶1.2 μL、dNTP 4 μL、ddH2O 71.2 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。将PCR产物于琼脂糖凝胶中电泳检测，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒收集目的基因组。1.4.3原核表达的载体构建酶切与提纯用限制性内切酶Nde Ι、EcoR Ι对PET-42b载体及其基因片段进行双酶切。pET42b质粒体系（50 μL）：载体30 μL、10× buffer 4 μL、ddH2O 10 μL、Nde Ι 3 μL、Xho Ι 3 μL。切胶回收产物体系（50 μL）：切胶回收产物35 μL、10× buffer 2 μL、ddH2O 11 μL、Nde Ι 1 μL、Xho Ι 1 μL。37 ℃酶切3 h，回收纯化，产物于-20 ℃保存。1.4.4连接和转化将酶切产物与pET-42b载体于离心管中混匀，经16 ℃水浴过夜，将转化产物全部涂布于含有卡那霉素（kana）的固体LB培养皿上经37 ℃培养过夜。1.4.5菌液PCR鉴定及测序挑取单菌落于液体LB培养基中振摇培养，用菌液PCR检测，阳性菌液取50 μL送武汉市天一辉远公司测序。1.4.6测序分析将测序结果用DNAMAN进行序列对比分析，并与基因库中已发表的23个基因比较，用DNAStar建立遗传进化树，分析其遗传演化关系。1.4.7质粒提取经过菌液PCR和测序鉴定阳性的克隆多量培养提取质粒。1.4.8蛋白表达的检测将阳性质粒转入大肠杆菌BL21，涂布含有kana的LB平板培养。挑取单菌落于液体培养基活化3 h，加0.1 mmol/L的IPTG诱导表达5~6 h，取1 mL于1.5 mL离心管中12 000 r/min离心2 min，弃上清，加100 μL PBS溶液悬浮沉淀，于冰上超声破碎3 min，12 000 r/min离心2 min，将上清移至另一离心管中，沉淀中加100 μL PBS，分别加10 μL上样Buffer煮沸10 min。样品加至SDS-PAGE凝胶，每孔20 μL，120 V约2 h电泳，胶片用考马斯亮蓝染色2 h，甲醇-冰醋酸脱色观察。1.4.9表达蛋白的Western Blot鉴定如1.4.8操作得到电泳胶片，修整后置于经TBST Buffer浸泡置于转膜夹上的多层滤纸上，剪取同尺寸的NC膜经TBST Buffer浸泡后置于胶上，其上盖多层滤纸，扣好转膜夹并置于转膜槽中，120 V转膜45 min。NC膜于脱脂奶粉中封闭2 h，加一抗再转入His单抗中孵育2 h，用TBST Buffer洗15 min共3次，加二抗羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）孵育1 h。充分漂洗后，用DAB显色试剂显色，照相保存结果。1.4.10生物学软件分析根据测序结果与基因Bank中其他毒株的VLTF-3基因进行同源性分析，采用MEga 11软件进行遗传进化树预测分析。采用在线软件Signal P 4.1 Server和TMHMM Severv.2.0分别预测分析了晚转录因子VLTF-3基因蛋白的信号肽和跨膜结构的预测。采用在线软件NetOGlyc 4.0 Server和Prabi分别分析了其蛋白糖基化位点、磷酸化作用位点的预测及二级结构的预测。采用生物学在线软件SWISS-MODEL预测构建VLTF-3蛋白的三级结构模型。2结果与分析2.1VLTF-3基因PCR扩增结果（见图１）由图1可知，PCR扩增羊痘病毒VLTF-3基因，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带大小为681 bp，与预期目的片段大小一致。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.F001图1VLTF-3基因PCR扩增结果Fig.1PCR amplification results of VLTF-3 gene注 ： M为DNA Marker；1、2、3为VLTF-3基因。2.2VLTF-3菌液PCR鉴定结果（见图2）由图2可知，将VLTF-3的连接产物转化DH5α后进行菌液PCR鉴定，结果得到与预期大小相符的目的条带，表明试验成功构建了pET42b- VLTF-3重组质粒。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.F002图2VLTF-3菌液PCR鉴定结果Fig.2PCR identification results of VLTF-3 bacterial broth注 ： M为DNA Marker；1~7为VLTF-3基因。2.3VLTF-3基因的进化树检测结果（见图3）由图3可知，对羊痘病毒Thx株VLTF-3的测序结果与基因Bank中发表的其他毒株的该基因利用MEga 11软件将遗传进化树，显示该基因保守性较强，与皮肤疙瘩病遗传距离最近。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.F003图3VLTF-3基因的进化树检测结果Fig.3Evolutionary tree of VLTF-3 gene2.4VLTF-3蛋白SDS-PAGE电泳结果（见图4）由图4可知，采用SDS-PAGE进行电泳鉴定，结果显示蛋白大量表达在细胞上清，大小约为27 kDa，与预测的蛋白大小一致。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.F004图4VLTF-3蛋白SDS-PAGE电泳结果Fig.4Results of SDS-PAGE electrophoresis of VLTF-3 protein注 ： M为Marker；1为对照；2、3为重组质粒VLTF-3。2.5VLTF-3蛋白Western Blot鉴定结果（见图5）由图5可知，重组质粒pET-42b-gptv-088经活化IPTG的诱导后，完成了Western Blot鉴别，并获得了27 kDa大小的条带。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.F005图5VLTF-3蛋白Western Blot鉴定结果Fig.5Identification of VLTF-3 protein by Western Blot2.6VLTF-3基因特征分析VLTF-3的测序结果显示，该基因的全长约681个碱基，与参考株GTPV-Pellor同源度高达99%，GC含量为23.35；推测其编码227个氨基酸（aa），含有31个强碱性aa（K、R）、25个强酸性aa（D、E）、77个疏水性aa（A、I、L、F、W、V）、77个两性aa（N、C、Q、S、T、Y）；等电点为8.84，分子量为26.6 kDa。2.7VLTF-3基因生物信息学分析结果2.7.1晚转录因子VLTF-3蛋白信号肽分析（见图6）由图6可知，VLTF-3基因无信号肽，在N端前18aa具有信号肽功能，为非分泌型蛋白。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.F006图6晚转录因子VLTF-3蛋白信号肽分析Fig.6Analysis of late transcription factor VLTF-3 protein signal peptide2.7.2晚转录因子VLTF-3蛋白跨膜结构分析（见图7）由图7可知，VLTF-3蛋白为典型的非跨膜蛋白，共计227个氨基酸，所有序列均在膜内，即该序列编码的是非分泌蛋白。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.F007图7晚转录因子VLTF-3蛋白跨膜结构分析Fig.7Analysis of transmembrane structure of late transcription factor VLTF-3 protein2.7.3VLTF-3糖基化位点和磷酸化的作用位点分析（见图8）由图8可知，该蛋白中缺乏糖基化位点，共计22个磷酸化作用位点，其中含有13个丝氨酸（18、30、36、38、48、63、67、72、84、85、95、120、224）和5个苏氨酸（148、169、176、203、222）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.F008图8VLTF-3糖基化位点和磷酸化的作用位点分析Fig.8Analysis of VLTF-3 glycosylation sites and phosphorylated sites of action2.7.4VLTF-3蛋白结构预测分析（见图9、图10）由图9可知，该蛋白由79个aa构成α螺旋，占氨基酸总量的34.80%；52个aa构成延伸链，占氨基酸总量的22.91%；15个aa构成β-转角，占氨基酸总量的6.61%；81个aa构成不规则卷曲，占氨基酸总量的35.68%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.F009图9VLTF-3蛋白二级分子结构的预测分析Fig.9Predictive analysis of secondary molecular structure of VLTF-3 protein由图10可知，在线软件SWISS-MODEL预测构建VLTF-3蛋白的三级结构模型，显示该蛋白大部分以α螺旋为主。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.12.001.F010图10VLTF-3蛋白三级结构的预测图分析Fig.10Predictive graphical analysis of tertiary structure of VLTF-3 protein3讨论转录因子是一种可与特异性DNA序列融合的蛋白，能够独立或与其他蛋白组成复合体[11-13]，以增加或抑制特异性基因对RNA聚合酶的吸收，或控制该基因的表达。转录因子必须是一个能够与目的基因5'端上游的特异序列专一性融合，进而使目的基因以一定强度并在一定时间与空间内表达的蛋白质分子。而转录因子也必须在核内作用[14-15]，可发挥调控表达的重要功能。因此，转录因子上的核定位序列也是其关键的组成部分。大多数的转录因子在融合DNA前均需要经过蛋白质-蛋白质作用成为二聚体或多聚体，转录过程是由于转录因子上的寡聚化位点（oligomerization site）共同作用的结果[16]，寡聚化位点的氨基酸序列保守性较好，且大多与DNA结合区连接而产生了相应的新结构。羊痘病毒是在真核生物细胞的细胞质中生长的大型双链DNA病毒[17-18]，在细胞核外复制的能力主要取决于能够融合DNA并转录的病毒蛋白的表达。转录程序被分为早期、中期和晚期，由阶段特异性启动子和转录因子与多亚单位RNA聚合酶共同调控。羊痘病毒共含有4种晚转录因子，本研究利用克隆表达山羊痘病毒晚转录因子VLTF-3，以深入研究研究羊痘病毒转录因子VLTF-3的生物功能和特性[19-20]，并利用PCR技术扩增目的基因，扩增后的DNA将转录因子从细胞核引入细胞质，从而激活晚转录因子VLTF-3进行转录。结果显示，琼脂多糖经凝胶电泳后，通过凝胶成像系统观测到大小为681 bp的条带，与预期大小一致。而利用SDS-PAGE电泳和Western Blot蛋白印迹法测定发现，目的蛋白大小约在27 kDa，表明已成功建立和表达了该重组质粒。将检测结果经DNAMAN分析，发现其余Pellor毒株的同源性达到99%；再用DNAStar解析，发现该基因含有227个氨基酸，蛋白质大小为27 kDa。该基因中A占41.26%，G占13.36%，T占35.39%，C占9.99%。而遗传进化树研究表明，该基因保守性比较好，与皮肤疙瘩病株关系密切，原因可能是皮肤疙瘩病病毒和山羊痘病毒基因组约有96%的核苷酸完全相同，或该基因组保守性非常强。与张成等[21]的试验相比，本试验也是利用在线软件Prab解析了VLTF-3蛋白的二级结构，结果表明，该蛋白中有79个aa构成α螺旋，占氨基酸总量的34.80%；52个aa构成延伸链，占氨基酸总量的22.91%；15个aa构成β-转角，占氨基酸总量的6.61%；81个aa构成无规则卷曲，占氨基酸总量的35.68%。VLTF-3蛋白为膜蛋白，且为非跨膜蛋白，所有序列均在膜内。VLTF-3蛋白以α螺旋为主且相比VLTF-1蛋白更稳定，更易于抗体结合，可作为抗原表位。痘病毒转录需要RNA聚合酶结合到双链DNA，双链打开，聚合酶沿着5'端向3'端滑动，生成单链DNA，直至遇到转录终止信号，合成的RNA脱离，完成加帽、polyA化、内含子剪切。本试验旨对VLTF-3蛋白的氨基酸特性进行研究，发现该蛋白符合这样的转录特性，推测该蛋白具有终止转录的信号，预测VLTF-3蛋白是膜蛋白，晚转录因子VLTF-3除了在晚期转录中发挥重要作用，还可能在病毒核心的形成和组装中发挥重要作用。痘病毒是大型DNA病毒，在细胞的细胞质区室中完全复制，编码自身的多亚基RNA聚合酶和基因特异性转录和终止因素。病毒编码的RNA聚合酶与真核RNA聚合酶具有序列和结构同源性。痘病毒编码的细胞蛋白通过将病毒RNA聚合酶募集到3种不同基因中的一种调节启动子的特异性，痘病毒与细胞之间的功能转录与基因调控是今后一种崭新的前沿领域痘病毒生物学，针对上述转录系统可能作为一种未开发和有效的抗病毒策略。一般在真核生物转录中对抗痘病毒感染往往比较复杂[22]，且需要多种蛋白因子的操作。VLTF-3基因蛋白保守性较强，与皮肤疙瘩病最为接近。虽然27 kDa蛋白表达量少，但VLTF-3基因的转录为普遍转录因子，需要一定的酶才能够进行转录。为更进一步验证VLFT-3蛋白的生物学特性，宿主细胞核转录因子与痘病毒复制后转录以及其他病毒过程的整合是今后一个新兴研究领域。4结论综上所述，本研究成功利用PCR技术扩增晚转录因子VLTF-3基因，成功构建一个原核表达载体，分析得出晚转录因子VLTF-3蛋白的生物学特性并制备该蛋白。研究羊痘病毒晚转录因子VLTF-3在病毒转录中的致病机制及其生物学特性、功能，为今后的羊痘病毒致病机制的研究提供一定参考。