铜绿假单胞菌是一种拥有极强的环境适应能力和生存能力的条件致病菌，广泛分布于水、空气、土壤以及人和动物的皮肤、消化道、呼吸道和尿道中[1]。铜绿假单胞菌是引起医院内感染的常见条件性致病菌之一，可产生多种细菌毒素并可引起人体感染肺炎等多种疾病[2]，还能够感染包括禽类、哺乳类、水产类等在内的多种动物。因此，铜绿假单胞菌也是一种常见的人畜共患病原菌[3-4]。目前临床中仍主要通过抗生素对铜绿假单胞菌进行控制，但随着抗生素长期大量应用，该菌对各种抗生素均产生了不同程度的耐药性。市面上治疗铜绿假单胞菌的β-内酰胺类、氨基糖甙类、喹诺酮类、碳青霉烯类等多种类型的抗生素均难以应对耐药菌株的耐药变迁，可用于治疗该菌感染的药物越来越少[5]。且耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌已被WHO列为急需新药开发以控制感染的三大病原菌之一[6]。鉴于此，亟须寻求更加有效的措施以控制该病原菌造成的危害。针对传染性疾病，除常规药物治疗外，免疫预防也是常用且重要的防控措施之一。但对铜绿假单胞菌而言，目前尚无可用于医学临床和兽医临床的商品化疫苗。因此，研制新型高效疫苗对该病原菌的防治具有重要的现实意义。本试验选取铜绿假单胞菌的保护性抗原基因之一oprH，以真核表达载体pCAGGS-HA构建了该基因的DNA疫苗，以期为铜绿假单胞菌新型疫苗的研究提供一定参考。1材料与方法1.1试验材料铜绿假单胞菌购自中国兽医药品监察所。真核表达载体pCAGGS-HA和大肠杆菌感受态细胞DH5α均由河南科技大学食品与生物工程学院微生物基因工程实验室保存。引物合成与基因测序由上海生工生物工程有限公司完成。Taq DNA聚合酶、T-Vector pMDTM19、T4 DNA连接酶、限制性内切酶XhoⅠ、KpnⅠ、DNA Marker DL15000、DL10000及DL2000均购自Takara公司。胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。试验所用仪器设备主要包括PCR仪（DLAB公司）、低温水浴锅（杭州齐威仪器有限公司）、冷冻离心机（凯特实验仪器有限公司）。1.2引物设计与合成根据GenBank上已发表的铜绿假单胞oprH基因的全序列及真核表达载体pCAGGS-HA上的多克隆位点设计合成用于扩增该基因的特异性引物，上、下游引物分别含有KpnⅠ和XhoⅠ位点。引物序列见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.005.T001表1引物序列Tab.1Primer sequences目的基因引物序列(5'→3')引物长度/bpoprHUH：CGGGGTACCATGAAAGCACTCAAGACT610LH：CCGCTCGAGTTAGAACTTGTAGTTGGC1.3铜绿假单胞菌基因组DNA的提取将活化后的铜绿假单胞菌种子液以1%的接种量接种于5 mL LB培养液中，于37 ℃条件下，180 r/min振荡培养12 h。之后取1.5 mL菌液12 000 r/min离心2 min，弃上清后加入567 μL的TE缓冲液重悬菌体，加入30 μL 10%的SDS和15 μL蛋白酶K，混匀后置于37 ℃水浴中作用1 h。反应结束后加入100 μL 5 mol/L的氯化钠和80 μL十六烷基二甲基溴化铵（CTAB）混匀，置于65 ℃水浴中反应10 min。再向其中加入与离心管中液体等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液（氯仿和异戊醇的比例为24∶1），12 000 r/min离心5 min，加入与上清等量的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液（苯酚、氯仿和异戊醇的比例为25∶24∶1），12 000 r/min离心5 min。再向上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，12 000 r/min离心5 min，弃去上清，向沉淀中加入20 μL TE溶解，取2 μL进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.4目的基因的PCR扩增与纯化以提取的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，以上述引物对oprH基因进行PCR扩增。反应体系：2×Taq Mix DNA聚合酶12.5 μL、模板DNA 1 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、无菌ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循环30次；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保温。反应结束对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过胶回收试剂盒并按照说明书进行操作，回收纯化oprH基因的目的片段，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。1.5oprH基因与T载体的连接与转化以T4 DNA连接酶将上述回收纯化且测序正确的oprH基因的PCR产物与T-Vector pMD™19进行连接。连接体系含1 μL的T-Vector pMD™19、7 μL纯化后的PCR产物、1 μL T4 DNA连接酶和1 μL T4 DNA连接酶Buffer。上述各成分混匀，于低温水浴锅中16 ℃连接过夜。以CaCl2法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，将上述连接产物加入100 μL DH5α感受态细胞中，混匀后冰水中放置30 min，42 ℃热激90 s，冰浴2 min。之后将其加入1 mL LB液体培养基中37 ℃ 180 r/min振荡培养90 min，2 000 r/min离心1 min，弃掉上清，以100 μL无菌水重悬后均匀涂布于含有50 mg/L氨苄青霉素的LB培养平板上，37 ℃倒置培养12~16 h。1.6T-oprH重组质粒的酶切和PCR鉴定由上述培养平板上随机挑取菌落，在含50 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中接种培养，随后取1.5 mL菌液以碱裂解法提取质粒，取2 μL以0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。随后对提取的质粒用KpnⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，反应体系含质粒2 μL、限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ各0.5 μL、10×M buffer 1 μL、无菌ddH2O 6 μL。混匀后37 ℃水浴中反应2 h，反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。同时取1 μL提取的质粒，以上述UH和LH引物进行PCR鉴定，并设置以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板的阳性对照和以无菌水为模板的阴性对照。反应体系和反应条件同1.4，PCR反应结束后取2 μL PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。将双酶切鉴定和PCR鉴定均为阳性的重组质粒命名为T-oprH。1.7oprH基因的亚克隆以限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ对T-oprH进行大量酶切。反应体系总体积（50 μL），包括T-oprH质粒20 μL、KpnⅠ和XhoⅠ各3 μL、10×M buffer 5 μL、无菌ddH2O 19 μL。混匀后37 ℃水浴中酶切2 h，之后进行1%的琼脂糖凝胶，并以胶回收试剂盒对目的片段进行回收纯化。同时按上述反应体系和反应条件对真核表达载体pCAGGS-HA以KpnⅠ和XhoⅠ进行双酶切并回收纯化。取7 μL上述酶切并回收纯化后的oprH基因，向其中加入双酶切处理后的pCAGGS-HA、T4连接酶和T4连接酶Buffer各1 μL，混匀后16 ℃水浴连接8 h。制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，将上述连接产物转入其中，涂布于含氨苄青霉素的LB培养平板上，37 ℃倒置培养12~16 h。1.8pCAGGS-HA-oprH重组质粒的提取与鉴定按上述1.6的方法，挑取培养平板上的单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，12 h后提取质粒，取2 μL提取的质粒用KpnⅠ/XhoⅠ酶进行双酶切鉴定。同时以提取的质粒为模板，以UH和LH为引物进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测鉴定结果。阳性重组质粒即为oprH基因的DNA疫苗，将其命名为poprH。2结果与分析2.1铜绿假单胞菌的基因组提取结果（见图1）由图1可知，以CTAB法提取铜绿假单胞菌的基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图谱上出现大于15 000 bp的条带，表明基因组DNA提取成功。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.005.F001图1铜绿假单胞菌的基因组提取结果Fig.1Result of genome extraction of Pseudomonas aeruginosa注 ： M为DNA Marker DL15000；1、2为铜绿假单胞菌基因组DNA。2.2铜绿假单胞菌oprH基因的PCR扩增结果（见图2）由图2可知，以铜绿假单胞菌的基因组DNA为模板，以特异性引物PCR扩增oprH基因，并进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增获得大小约为610 bp的特异性DNA片段，与预期大小一致。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.005.F002图2铜绿假单胞菌oprH基因的PCR扩增结果Fig.2PCR amplification results of oprH gene of Pseudomonas aeruginosa注 ： M为DNA Marker DL2000；1、2为铜绿假单胞菌oprH基因的PCR扩增产物。2.3重组质粒T-oprH的提取及鉴定结果（见图3~图5）XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.005.F003图3T-oprH重组质粒的提取结果Fig.3Extraction result of T-oprH recombinant plasmid注 ： M为DNA Marker DL10000；1~3为T-poprH重组质粒。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.005.F004图4T-oprH双酶切鉴定结果Fig.4Identification results of T-oprH double enzyme digestion注 ： M为DNA Marker DL2000；1为重组质粒T-oprH的双酶切结果。由图3~图5可知，将纯化后的oprH基因与T-Vector pMD™19载体连接后转化入大肠杆菌感受态细胞中，提取重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图谱上在接近4 000 bp处出现DNA条带，与预期大小一致。提取的质粒以KpnⅠ和XhoⅠ双酶切进行鉴定，双酶切后获得大小约为610 bp的DNA条带，与目的基因大小一致。以提取的质粒为模板进行PCR鉴定，PCR成功扩增出610 bp的特异性条带。上述结果表明，重组质粒T-oprH构建成功。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.005.F005图5T-oprH的PCR鉴定结果Fig.5PCR identification results of T-oprH注 ： M为DNA Marker DL2000；1、2：T-oprH的PCR扩增结果；3为阳性对照；4为阴性对照。2.4poprH重组质粒的提取及验证结果（见图6~图8）XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.005.F006图6poprH重组质粒的提取结果Fig.6Extraction results of recombinant plasmid poprH注 ： M为DNA Marker DL10000；1~3为重组质粒poprH。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.005.F007图7poprH双酶切鉴定结果Fig.7Identification results of poprH double enzyme digestion注 ： M为DNA Marker DL2000；1、2为重组质粒poprH的双酶切鉴定结果。由图6~图8可知，由重组质粒T-oprH中双酶切获得oprH基因，并将其与同样酶切处理过的真核表达载体pCAGGS-HA连接，转化入大肠杆菌感受态细胞中，提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图谱上的DNA片段大小介于5 000和7 000 bp之间，与重组质粒的预期大小一致。提取的质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定，结果均可获得大小约为610 bp的DNA条带，与oprH基因大小相同。结果表明，oprH基因成功克隆入pCAGGS-HA中，即oprH基因的DNA疫苗构建成功。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.005.F008图8poprH的PCR鉴定结果Fig.8PCR identification results of poprH注 ： M为DNA Marker DL2000；1、2为poprH的PCR扩增结果；3为阳性对照；4为阴性对照。3讨论铜绿假单胞菌作为一种人畜共患病原菌，因其耐药性不断提高，导致治疗难度日益增加，对人类健康和畜牧业发展造成了极大危害。为有效防控铜绿假单胞菌病，必须加强对该病原菌疫苗的研制和临床应用。目前国内外对该菌疫苗的研究报道不在少数，包括灭活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗等[7-11]。其中，作为新一代疫苗的DNA疫苗具有制备成本较低、免疫力持久、不存在减毒疫苗毒力回升风险等优点，已成为疫苗研究领域的热点之一。在新型疫苗研究过程中，选择有效的保护性抗原基因是决定其免疫效果的关键因素之一。应用于制备铜绿假单胞菌新型疫苗的免疫原基因包括外膜蛋白基因、菌毛蛋白基因、鞭毛蛋白基因以及外毒素基因等[12]。铜绿假单胞菌的外膜蛋白由oprF、oprL、oprI、oprH等20多种基因编码产生，多种外膜蛋白的编码基因均可作为制备新型疫苗的候选基因，其中以oprF、oprL等基因制备重组亚单位疫苗和DNA疫苗的研究报道较多见，而以oprH等外膜蛋白基因制备DNA疫苗的研究则相对较少[13-14]。罗晓庆等[15]将oprH基因与原核表达载体pET28b连接构建了重组质粒，并导入大肠杆菌中表达了重组蛋白，为该基因亚单位疫苗的制备奠定了基础。刘祥[16]检测了oprH基因的重组蛋白诱导免疫小鼠的抗体水平及其为小鼠提供的保护效果，结果表明，该基因编码的蛋白具有较好的免疫原性。因此，oprH基因是铜绿假单胞菌主要的保护性抗原基因之一，可作为新型疫苗研究的候选基因。基于此，本试验以PCR方法扩增了铜绿假单胞菌的oprH基因，将其与T载体连接后又成功亚克隆于真核表达载体pCAGGS-HA中，构建了该基因的DNA疫苗，从而为研制基于oprH基因的铜绿假单胞菌新型疫苗提供参考。4结论本试验以铜绿假单胞菌外膜蛋白编码基因之一的oprH为靶基因，以真核表达载体pCAGGS-HA为载体，成功构建了该基因的DNA疫苗，为进一步研究oprH基因DNA疫苗的免疫保护效果及铜绿假单胞菌新型疫苗的研发提供参考。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.005.F009