仔猪的黄痢及白痢由产肠毒素大肠杆菌引起。仔猪黄痢又称早发型大肠杆菌病，以仔猪产黄色水样粪便为主要特征，主要发生在7日龄以内的仔猪。仔猪白痢又称迟发型大肠杆菌病，以灰白色粥状粪便为主要临床特征，一般以10~30日龄的仔猪多发[1]。抗生素可有效控制细菌疾病，但随着用量增加、环境压力提升等导致细菌耐药性问题愈发严重。其中产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌分布较为广泛，且检出率逐渐增多[2]。产超广谱β-内酰胺酶可有效水解β-内酰胺类药物，但可被克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂抑制[3]。产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌携带的耐药基因包括TEM、SHV及CTX-M，通过PCR进行耐药基因检测可快速有效发现大肠杆菌是否携带产超广谱β-内酰胺酶耐药基因[4]。2021年秋季，哈尔滨地区某规模化养猪场内仔猪出现腹泻症状，经实验室检测确定病原菌为产肠毒素致病性大肠杆菌。药敏试验结果发现，该株细菌对β-内酰胺类药物耐药情况严重，应用PCR探究该株产肠毒素仔猪腹泻大肠杆菌携带的耐药基因，以期为该场科学用药提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株试验菌株为哈尔滨地区腹泻死亡腹泻仔猪器官中分离的大肠杆菌，质控菌株为ATCC25922大肠杆菌（由哈尔滨兽医研究所赠予）。1.1.2试验试剂麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、MH琼脂培养基及MH肉汤（青岛海博生物科技有限公司），2×Taq Master Mix、DNA marker（诺唯赞生物科技股份有限公司），DNA提取试剂盒（天根生物科技有限公司），药敏纸片（杭州滨和生物科技有限公司）。DNA引物由吉林库美生物科技有限公司合成。1.1.3试验仪器麦氏比浊仪、恒温培养箱（北京天安联合科技有限公司），凝胶成像仪、PCR仪（伯乐生命医学产品有限公司），无菌操作台（苏州苏信环境科技有限公司），恒温摇床（泰斯特仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1细菌分离及鉴定1.2.1.1细菌培养腹泻仔猪粪便和死亡仔猪器官样本涂抹在麦康凯和伊红美蓝培养基上，37 ℃恒温培养16 h。1.2.1.2生化试验取麦康凯培养基上的粉红色菌落及伊红美蓝培养基上带有金属光泽的菌落进行生化试验。1.2.1.316S rRNA检测根据相关文献进行大肠杆菌16S rRNA引物合成，进行细菌16S rRNA检测。引物序列见表1[5]。将阳性的PCR产物送到吉林库美生物科技有限公司进行测序，测序结果提交到GenBank上进行同源序列查找。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.003.T001表116S rRNA引物序列Tab.116S rRNA primer sequence引物名称序列(5'→3')引物长度/bp16S rRNAF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG1 543R：TACGGTTACCTTGTTACGACTT1.2.2致病性试验分离大肠杆菌菌落，采用伊红美蓝培养基培养后进行致病性试验。细菌菌落用MH肉汤培养，取24只小鼠进行试验，分为3株分离株试验组和对照组，每组6只。试验组小鼠腹腔注射0.2 mL菌液（浓度为109 CFU/mL），对照组注射等体积无菌生理盐水。1.2.3毒力基因检测将已经确认可致病的大肠杆菌参照相关文献进行毒力基因检测[6]。毒力基因序列见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.003.T002表2毒力基因序列Tab.2Virulence gene sequence引物名称序列(5'→3')引物长度/bpF41F：GATGAAAAAGACTCTGATTGCAR：TCTGAGGTCATCCCAATTGTGG682K99F：CTGAAAAAAACACTGCTAGCTATTR：CATATAAGTGACTAAGAAGGATGC543987PF：GTTACTGCCAGTCTATGCCAAGTGR：TCGGTGTACCTGCTGAACGAATAG463K88F：GATTGCTACGTTCAGCGGAGCGR：GATGAAAAAGACTCTGATTGCA8411.2.4药敏试验参照相关文献进行药敏试验[7]。将纯培养的细菌菌落用MH肉汤培养过夜，应用比浊仪稀释到0.5麦氏单位后，将细菌菌液均匀涂抹在MH琼脂培养基上。将药敏纸片放置在琼脂上，放入37 ℃培养箱中培养过夜。第2 d进行抑菌环记录，与CLSI文件进行对比。1.2.5耐药基因的检测将大肠杆菌的单菌落在伊红美蓝培养基上连续培养3代进行纯化。纯化后的细菌用MH肉汤培养过夜，应用DNA提取试剂盒进行细菌DNA提取，根据相关文献进行耐药基因的检测[8-9]。耐药基因序列见表3。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.003.T003表3耐药基因序列Tab.3Drug resistance gene sequence引物名称序列(5'→3')引物长度/bpblaTEMF：CGCCGCATACACTATTCTCAGAATGAR：ACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT445blaCTX-MF：ATGTGAGYACCAGTAARGTKATGGCR：TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAG593blaSHVF：ATGCGTTATATTCGCCTGTGR：TGCTTTGTTATTCGGGCCAA747qnrAF：AGAGGATTTCTCACGCCAGGR：TGCCAGGCACAGATCTTGAC580qepAF：CTTGCACTTAGTTAAGCGCCR：GAGGTTTTGATAGTGGAGGTAGG866aac(6')-Ib-crF：TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTAR：CTCGAATGCCTGGCGTGTTT482PCR体系（25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL、上下游引物各0.8 μL、模板1.5 μL、ddH2O 9.4 μL。反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。2结果与分析2.1细菌分离鉴定结果2.1.1细菌分离培养（见图1）由图1可知，从腹泻仔猪粪便及死亡仔猪器官中分离出大肠杆菌3株，分离株在麦康凯培养基上长出粉红色菌落，在伊红美蓝培养基上长出黑色带有金属光泽的菌落。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.003.F001图1菌落形态Fig.1Colony morphology2.1.2细菌生化试验结果生化试验结果显示，麦芽糖、甘露醇、吲哚、乳糖、L-鼠李糖、葡萄糖试验阳性，VP、尿素酶试验阴性。2.1.3细菌16S rRNA检测结果3株大肠杆菌16S rRNA结果均为阳性；阳性PCR产物进行测序后，将测序结果提交GenBank上进行同源性对比，发现与大肠杆菌序列同源性均大于99%。2.2致病性试验结果致病性试验结果显示，只有1株大肠杆菌可使小鼠在6 h内出现腹泻、精神沉郁及死亡现象，通过小鼠致病性试验确认为致病性大肠杆菌。2.3毒力基因检测结果（见图2）由图2可知，该致病性大肠杆菌携带K99黏附素，为产肠毒素性大肠杆菌。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.003.F002图2毒力基因检测结果Fig.2Toxicity gene detection results注 ： M为DL2000 Marker；1为BlaCTX-M阳性对照菌株；2为分离菌株。2.4药敏试验结果（见表4）由表4可知，3株分离株对青霉素、头孢噻肟、头孢曲松及头孢哌酮等β-内酰胺类药物极为耐药，对喹诺酮类药物较为敏感，对庆大霉素为中介状态。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.003.T004表4药敏试验结果Tab.4Drug sensitivity test results项目抑菌环直径/mm敏感程度青霉素G4.7±1.2耐药头孢噻肟6.2±0.8耐药头孢曲松7.4±1.3耐药头孢哌酮5.9±1.4耐药头孢克肟6.9±0.8耐药恩诺沙星25.7±3.2敏感环丙沙星26.2±2.6敏感庆大霉素13.2±1.6中介2.5耐药基因检测结果（见图3）由图3可知，该株仔猪腹泻产肠毒素大肠杆菌检出blaCTX-M耐药基因，其他耐药基因并未检出，表明该株大肠杆菌为产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌，可产出β-内酰胺酶水解β-内酰胺类抗生素，从而对β-内酰胺类药物产生耐药性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.003.F003图3耐药基因检测结果Fig.3Drug resistance gene detection results注 ： M为DL2000 Marker；1为BlaCTX-M阳性对照菌株；2为分离菌株。3讨论产肠毒素大肠杆菌是造成仔猪腹泻的重要病原菌之一，可引起仔猪的黄痢与白痢，严重时甚至导致仔猪死亡[10]。产肠毒素大肠杆菌具有黏附素毒力基因和肠毒素毒力基因，其中常见的黏附素毒力基因包括K88、K99、987P及F41等，常见的肠毒素毒力基因包括热不稳定型肠毒素LT和热稳定型肠毒素ST基因。国内检出较多的黏附素毒力基因为K88、987P毒力基因，F41黏附素毒力基因检出较少。目前针对产肠毒素大肠杆菌的防治多采用药物和疫苗，疫苗的种类包括全菌灭活疫苗、基因工程疫苗、弱毒疫苗及DNA疫苗等。国内已有多种品牌的K88、K99及987P三价全菌灭活疫苗应用于产肠毒素大肠杆菌仔猪腹泻的预防[11]。使用药物防治则包括化学药物及中药制剂。化学药物多使用β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类及四环素类药物。但随着抗生素使用、环境压力显著提升，导致敏感细菌大量死亡，耐药细菌大量产生。并且随着耐药质粒在细菌间大量水平传播，导致细菌耐药情况愈发严重[12]，多种细菌甚至发展成多重耐药的超级细菌。其中针对β-内酰胺类抗生素的耐药机制多为产生β-内酰胺酶。β-内酰胺酶由染色体或质粒编码产生，可有效将β-内酰胺环进行水解，从而使药物失活。大肠杆菌可产生的β-内酰胺酶种类较多，按照功能可将其分为4类：Bush1、Bush2、Bush3以及Bush4类。超广谱β-内酰胺酶为Bush2类酶，可有效水解β-内酰胺环，主要有TEM、CTX-M、SHV和OXA型酶。其中CTX-M为超广谱β-内酰胺酶中主要的酶，可分离自人类、动物及环境中的细菌。CTX-M基因在多种动物源的大肠杆菌中检出，以猪源大肠杆菌中检出率较高，且携带CTX-M基因的大肠杆菌耐药情况严重。杨守深等[13]对猪源CTX-M型产超广谱β-内酰胺酶阳性大肠杆菌耐药基因的流行性进行分析，发现测试菌株对头孢噻呋、头孢噻肟全部耐药，94%的菌株对四环素耐药，对阿米卡星敏感性较好。面对愈发严重的细菌耐药性问题，农业农村部颁布第194号公告，标志饲料端全面禁用抗生素。许多研究也以消除细菌耐药性为目的开展，其中中药消除细菌耐药性的研究较多，较为成熟。中药消除细菌耐药性的机制包括消除耐药质粒、抑制β-内酰胺酶活性、改变细胞膜通透性及抑制细菌外排泵作用等[14]。刘洋[15]进行了消除鸡源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药中药的筛选，发现山楂水提取物能够消除大肠杆菌对9种β-内酰胺类药物的耐药性，可有效消除与产生β-内酰胺酶有关的耐药质粒，从而遏制甚至扭转大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药性。中药与化药的联合应用可有效治疗耐药细菌造成的疾病。4结论本试验从仔猪腹泻样本中分离1株产肠毒素大肠杆菌，并进行药敏试验及耐药基因检测。结果发现，分离株对β-内酰胺类药物极度耐药，携带CTX-M耐药基因，为产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌。该株细菌对喹诺酮类药物敏感，对庆大霉素中介。