绵羊无浆体病是在绵羊和山羊体内由专性寄生的蜱传性的血液传染病，旧称边虫病[1-2]，广泛存在于热带和亚热带地区，温带地区也有少量分布[3]。1983年，马玉良等[4]首次在新疆发现绵羊无浆体感染，随后辽宁、内蒙古、甘肃、陕西、宁夏、青海、河南、山东、四川等地区[5-9]相继出现绵羊无浆体的报道。该病主要破坏动物的红细胞，绵羊感染该病后出现消瘦、贫血、黄疸等临床症状，造成生长发育缓慢、料重比增高、急性感染时甚至会导致动物死亡[10]。目前，基层地区检测绵羊无浆体病的主要方法有吉姆萨染色法，但吉姆萨染色法只能在动物感染后16~22 d检出虫体，检出率低。因此，本试验采用巢式PCR法，通过MSP4基因和16S rRNA基因设计并合成引物，进行无浆体病感病率检测，并对数据进行统计分析，进行流行病学调查，进而为南疆地区绵羊无浆体病的防控工作提供参考。1材料与方法1.1样品采集对南疆4个地区637只绵羊进行一次性无菌颈静脉采血并编号，保存于4 ℃恒温箱中备用。阳性样品由河南农业大学兽医寄生虫学实验室馈赠。南疆4地区采样地点分布及采样数量见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.017.T001表1绵羊血液样品统计表Tab.1Sheep blood sample statistics table地区采样点样品数编号喀什地区（278份）疏勒县201 439~1 458喀什市241 459~1 488疏附县281 489~1 518岳普湖县351 519~1 578叶城县201 609~1 643图木舒克市201 644~1 663莎车县201 704~1 724英吉沙县161 789~1 808泽普县201 849~1 868麦盖提县201 968~1 990巴楚县352 147~2 167伽师县202 207~2 235阿克苏地区（190份）库车县1101~1 207温宿县441 208~1 257沙雅县501 258~1 277柯坪县361 278~1 312阿瓦提县291 389~1 438巴音郭楞地区（139份）铁门关市202 236~2 271和硕县162 300~2 363博湖县242 365~2 437和田地区（30份）策勒县242 236~2 2711.2试验试剂与仪器试剂：Gold view染料购自苏区金唯智生物科技有限公司；d NTP Mixture购自北京全式金生物技术有限公司；DL2000 Marker购自北京华大生物科技有限公司；Agarose购自北京沃比森科技有限公司；全血DNA快速提取试剂盒购自北京华大生物科技有限公司。仪器：SW-CJ-2F净化工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、5415R小型台式高速冷冻离心机（Eppendorf公司）、Vortex Geni2涡旋混合器（Sciectific Industries 公司）、HVE-50高压灭菌锅（HIPAYAMA公司）、Mini-PROTEAN Tetra电泳槽（北京六一仪器厂）、GEL DOC XR+凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司），TProfessional PCR扩增仪（德国Biometra公司）。1.3试验方法1.3.1绵羊全血DNA的提取和巢式PCR扩增按北京华大生物科技有限公司生产的全血DNA快速提取试剂盒说明书提取羊全血DNA。参照王贵强[11]设计的引物序列进行试验。其中，特异性引物由北京华大基因公司合成。羊无浆体引物序列见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.017.T002表2绵羊无浆体引物序列Tab.2Anaplasma ovis primer sequence引物名称第1套PCR引物第2套PCR引物A.ovisAO1：5′-GCTCCCTACTTGTTAGTGG-3′AO3：5′-CAAGCAGAGAGACCTCGTAT-3′AO2：5′-TTAGCTGAACAGGAATCTTG-3′AO4：5′-GGCTTTTGCTTCTCCGGG-3′巢式PCR反应体系为：DNA模板1 μL、上游引物AO1/AO3和下游引物AO2/AO4各0.3 μL、dNTP Mixture 12.5 μL、加入10.9 μLddH2O补足至25 μL体系。第1轮PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行25个循环；72 ℃延伸反应10 min。第2轮PCR扩增程序预变性、变性、退火及延伸等后续步骤与第1轮PCR程序相同（变性至延伸过程重复35个循环）。1.3.2巢式PCR产物检测绵羊无浆体巢式PCR产物检测是将第1套引物扩增的产物稀释20倍，取1 μL作第2套引物扩增的模板，进行扩增。扩增后对PCR结果进行1%Agrose电泳进行检测。1.3.3 感染情况统计巢式PCR扩增出目的条带584 bp的样品为阳性样品，表示绵羊感染绵羊无浆体，统计4个地区绵羊无浆体感染情况。2结果与分析2.1巢式PCR检测结果（见图1）将绵羊无浆体（A.ovis）PCR扩增结果进行电泳，得到22份样品的PCR 1%Agrose电泳检测结果。由图1可知，本试验得到的绵羊无浆体的目的条带大小为584 bp，PCR结果与理论分子量一致。注：M为DL2000；N为阴性对照；P为阳性对照；1~22为部分样品A.ovis检测结果。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.017.F001图1绵羊全血部分样品的绵羊无浆体PCR检测结果Fig.1Anaplasma ovis PCR detection results of some samples of sheep whole blood2.2感染情况统计结果（见表3、图2、图3）由表3可知，喀什地区的巴楚县感染率高达91.4%，是21个县市中最高的，与于心等[12]对塔里木盆地地区蜱的分布情况相吻合，调查结果显示巴楚地区亚东璃眼蜱、短小扇头蜱和银盾革蜱均有分布且是优势种，优势蜱的广泛分布加剧了绵羊无浆体的分布。根据卡方检验，南疆4个地区的平均感染率差异极显著（χ2=26.914，P＜0.001）。巴州地区总体感染率为75.8%，是感染率最高的地区，与张玉婷等[13]调查巴州地区羊体表寄生的优势种革蜱情况相符。其余3地州各地区绵羊感染绵羊无浆体情况虽有不同但差距不大。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.017.T003表3南疆4地区无浆体病感染率Tab.3Infection rate of Anaplasma ovis in four areas of southern Xinjiang采样地点样品数绵羊的绵羊无浆体感染数/个感染率/%地区平均感染率/%合计63721233.333.3阿克苏地区库车县1102320.923.0温宿县44511.4沙雅县501632.0柯坪县361541.7阿瓦提县29310.3喀什地区叶城县20315.034.8喀什市24312.5莎车县20525.0岳普湖县35617.1英吉沙县16318.8疏附县28828.6疏勒县20315.0巴楚县353291.4图木舒克市201365.0泽普县201050.0伽师县20840.0麦盖提县20315.0巴区地区铁门关市201365.075.8和硕县161275.0博湖县242187.5和田地区策勒县30723.323.3由图2可知，南疆4地区各县市无浆体感染率在11.4%~91.4%范围内，其中阿克苏地区和和田地区感染率略低于南疆四地区平均值；喀什地区则略高于平均值；巴区地区明显高于4地区感染率平均值；各地区差异较大。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.017.F002图2南疆4地区无浆体病感染率误差图Fig.2Error map of Anaplasma ovis infection rate in four areas of Southern Xinjiang由图3可知，南疆4地区无浆体病感染率由高到低为巴区地区、喀什地区、和田地区、阿克苏地区，其中和田与阿克苏地区感染率较为接近，同为南疆四地区较低水平；喀什地区各县市无浆体病感染率差异最大，感染率最低的喀什市，最高的是巴楚县，相差7.3倍。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.017.F003图3南疆4地区无浆体病感染率Fig.3Infection rate of Anaplasma ovis infection rate in four areas of Southern Xinjiang3讨论无浆体病（anaplasmosis）的传播途径包括生物性传播、机械性传播和胎盘传播，其中蜱的生物性传播是最主要最有效的传播方式[14]。1990年，吕文顺等[15]通过传播试验确定亚东璃眼蜱、草原革蜱和短小扇头蜱是传播绵羊无浆体的媒介蜱。2018年，闻秀秀等[16]通过PCR检测和同源性分析确定银盾革蜱和边缘革蜱也是绵羊无浆体的媒介蜱。代艳艳等[17]对南疆地区牛羊蜱的调查结果显示，扇头蜱属和璃眼蜱属是南疆地区的优势蜱属，且南疆各地均有分布。因此，绵羊无浆体的感染情况和分布情况与蜱的分布直接相关，与本次调查结果相符。曲久等[18]调查西藏西北羌塘草原部分地区山羊的绵羊无浆体感染率为10.4%。张文静等[19]对中国陕西、云南、河南共12个县区奶山羊血液样品进行检测，绵羊无浆体总阳性率为23.0%。Liu等[20]对我国中南部绵羊无浆体进行流行病学调查，感病率为73.9%。孙明等[21]对甘肃省景泰县羊无浆体病感染率进行调查，感病率为30.6%。黄毓兰等[22]对云南省种羊繁育推广中心羊只进行无浆体检测的感病率达44.4%。南疆4地区无浆体病平均感病率为33.3%，处于中国中间水平。上述研究表明，绵羊无浆体病感病率差异性较大，与饲养方式、饲养环境等因素关联性较大。近年来，南疆地区畜牧业迅速发展，但饲养方式落后，多为“放牧+补饲”和“放牧+舍饲”[23]。在野外放牧条件下羊群易被蜱叮咬，这种落后的饲养方式造成南疆地区绵羊无浆体病的广泛分布。该病可致病羊日渐消瘦、生产性能下降，混合感染或继发感染更会导致死亡率增加[22]，严重影响绵羊养殖业的发展。该病的防治应防重于治，即控制媒介蜱。可采取轮换放牧和药物灭蜱联合进行达到控蜱灭蜱的目的。同时，应改变传统的放牧模式，集中科学饲养。4结论本试验发现，巴区、喀什、和田和阿克苏地区的感染率分别为75.8%、34.8%、23.3%和23.0%，平均感染率为33.3%，说明新疆南疆地区属于绵羊无浆体病高发地区需要加大防控力度。