牛是严格的单胎动物，在繁育方面难以满足社会发展需求，体外胚胎技术具有加速良种繁育和扩繁的特性而受到广泛关注。牛体外胚胎生产方面的研究多集中于体外培养模式的优化，包括培养液的优化改良[1-2]以及不同激素、生物因子等的应用[3-4]、序贯法培养[5-6]和共培养模式的建立等。而上述研究中以共培养模式的使用效果较好，在多种动物体外胚胎培养中均有报道。但目前国内外常用的共培养细胞主要为颗粒细胞单层、输卵管上皮细胞单层和成纤维细胞单层[7-10]，而作为直接与桑囊胚胎相接触的子宫角表皮细胞的相关研究并不多。子宫角作为胚胎后续发育的主要场所，其表皮细胞理论上参与了桑囊胚胎的形成过程，采用该细胞单层进行牛体外胚胎的共培养可能会对囊胚的生产效率起到一定促进作用。此外，卵母细胞质量也是一个影响胚胎发育的重要因素。质量好的卵母细胞能够完成胞质与核的成熟，质量差的则仅能够完成甚至难以完成核成熟，只有胞质与核均成熟的卵母细胞才有机会进一步发育到囊胚阶段。大量试验表明，裸卵能够进行正常体外受精[11-12]，但除特殊方法（如孤雌激活等）[13]外很难发育到囊胚阶段。而在采卵过程中，除卵丘-卵母细胞复合体（COCs）外，还常见一些透明状COCs，外周也具有多层卵丘细胞包裹，该类卵母细胞能够应用于试验生产，但其质量有待进一步试验验证。本文为优化牛体外胚胎生产体系，研究子宫角表皮细胞单层和FBS在培养液CR1aa中的使用效果，并对不同形态卵母细胞体外受精情况进行对比，以期获得一个更高生产效率的应用体系。1材料与方法1.1试验材料主要试剂：M199（南京森贝伽生物科技有限公司）、IVF-100受精液（Research Institute for the Functional Peptides）、胎牛血清（FBS，南京森贝伽生物科技有限公司）、卵泡刺激素（FSH，宁波三生制药）、黄体生成素（LH，宁波三生制药）。其他试剂均购自Sigma公司。主要仪器：HERAcell®150 i CO2培养箱、单人超净工作台（苏州净化设备有限公司），电子分析天平（赛多利斯公司），5702离心机（eppendorf公司），水浴锅（常州迈科诺仪器有限公司）。1.2卵母细胞采集卵巢来自沈阳市沈北新区某个体屠宰场。卵巢收集后置于含双抗的37 ℃生理盐水的保温杯中，于2 h内带回实验室，无菌生理盐水清洗5~6次。用带9号针头的10 mL无菌注射器抽取表面直径为2~8 mm卵泡中的卵泡液，于直径120 mm的细菌培养皿中进行捡卵。挑选具有3层以上正常形态的COCs、裸卵和透明状COCs用于体外成熟。采卵液和成熟液的配制参照黄承俊等[14]的方法。1.3子宫角表皮细胞单层制备子宫角为采集的卵巢所带。捡卵后，取输卵管端约2 cm长的子宫角，使用无菌手术剪从中间分开。采卵液洗3遍后，用无菌手术刀片轻轻刮取其内表皮少量的黏膜于含采卵液的细菌培养皿。移液枪收集液体，1 500 r/min离心10 min，之后用CR1aa培养液洗3遍。将其密度调整为约1×106 个/mL后，制成100 µL的微滴于CO2培养箱中培养，并于共培养前2 h半换液一次。1.4试验方法1.4.1体外成熟将挑选的形态良好的COCs、裸卵和透明状COCs于成熟液中洗3遍，之后分别于平衡至少2 h的含1 mL成熟液的4孔板中进行体外成熟培养。成熟条件为38.5 ℃、5% CO2的饱和湿度，培养时间为22~24 h。1.4.2体外受精精子的洗涤和体外受精参照黄承俊等[14]的方法。将成熟后的卵母细胞在受精液中洗3遍后，每10枚左右一组移入平衡至少2 h的50 µL受精微滴中，加入50 µL洗涤好的精子，于CO2培养箱中进行体外受精。受精条件为38.5 ℃、5% CO2的饱和湿度，受精时间为6 h。1.4.3体外培养1.4.3.1不同形态卵母细胞对牛体外胚胎生产体系的影响随机选取10枚假设受精的COCs、裸卵（3次试验中的数量分别为8、8和11枚）和透明状COCs（3次试验中的数量分别为6、6和7枚）分别于平衡至少2 h的100 µL CR1aa培养微滴中进行体外培养。培养条件为38.5 ℃、5% CO2饱和湿度，培养微滴每48 h换液一次。从体外受精开始算起，第48 h观察卵裂率，第7~8 d统计囊胚发育率。试验重复3次。1.4.3.2不同培养方法对牛体外胚胎生产体系的影响选用具有3层以上正常形态的COCs进行体外受精，分别用胚胎培养液CR1aa、CR1aa+10% FBS以及采用子宫角表皮细胞共培养方式对假设受精卵进行孵化，培养微滴每48 h换液一次。从体外受精开始算起，第48 h观察卵裂率，第7~8 d统计囊胚发育率。培养条件同前，试验重复3次。各组操作如下：CR1aa组：选取10枚假设受精的COCs于至少平衡2 h的100 µL CR1aa培养微滴中进行体外培养。CR1aa+10% FBS组：选取10枚假设受精的COCs于100 µL CR1aa培养微滴中培养，在受精开始后第3 d，转移至少平衡2 h的100 µL CR1aa+10% FBS培养微滴中培养。子宫角表皮细胞共培养组：选取10枚假设受精的COCs移入事先做好的100 µL子宫角表皮细胞单层微滴中进行培养。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析，假定方差齐性采用LSD、Duncan's法进行双侧检验，非齐性采用Dunnett's C进行检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同形态卵母细胞对牛体外胚胎生产体系的影响（见表1）由表1可知，仅COCs可以正常体外受精并发育到桑囊胚阶段。自然裸卵虽然可以正常体外受精，但卵裂率显著低于COCs（P0.05），且难以有效发育到囊胚阶段。透明状COCs则无法进行体外受精。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.004.T001表1不同形态卵母细胞对牛体外胚胎生产体系的影响Tab.1Effects of oocytes with different morphologies on bovine embryo production system in vitro组别卵母细胞数/个卵裂率/%囊胚率/%COCs10.00±0.0063.33±5.77a31.74±2.75a自然裸卵9.00±1.7325.76±1.31b0b透明状COCs6.67±0.580c0b注 ：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P0.05)；下表同。结果表明，在牛体外胚胎生产过程中，卵母细胞形态的选择很重要，只有COCs才能在受精后有概率进一步发育到囊胚阶段。2.2不同培养方法对牛体外胚胎生产体系的影响（见表2）由表2可知，10% FBS和子宫角表皮细胞单层均无法进一步促进体外受精卵发育，各组卵裂率和囊胚率差异均不显著（P0.05）。结果表明，本体系中10% FBS和子宫角表皮细胞单层的使用效果不明显。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.11.004.T002表2不同培养方法对牛体外胚胎生产体系的影响Tab.2Effects of different culture methods on bovine embryo production system in vitro组别卵母细胞数/个卵裂率/%囊胚率/%CR1aa10.00±0.0063.33±5.7731.74±2.75CR1aa+10% FBS10.00±0.0060.00±10.0032.14±9.45子宫角表皮细胞共培养10.00±0.0080.00±10.0028.97±4.183讨论卵母细胞是体外胚胎生产的基础物质，可直接影响整个体系的生产效果。试验希望能够获得更多最佳质量的卵母细胞，但在激素处理下，一个卵巢获得可用的COCs总数仍然有限[15]。因此，在生产中为获得更多可用试验材料，常扩大对卵母细胞的选择，半裸卵、裸卵和非常用形态的COCs（黏稠状、透明状、小卵母细胞状等）均得到不同程度的使用。但上述卵子质量不一，不同的选择会对体系造成很大差异。本试验中，裸卵能够正常体外受精，但卵裂率显著低于COCs组，与前人研究结论一致[11-12]，表明裸卵可用于正常的体外受精试验。但裸卵受精后的发育潜能比较低，基本难以发育到囊胚阶段，主要原因是卵母细胞成熟所需要的一些必要营养和信息物质是由卵丘-卵母细胞间隙连接完成，如卵泡刺激素（FSH）的信息调控[16-17]。这些营养和信息物质可能对卵母细胞胞质的成熟至关重要，若胞质在受精前仍得不到进一步激活（如孤雌激活）[13]，则卵母细胞受精后很难发育到囊胚阶段。因此，在生产可移植胚胎方面，裸卵的利用价值并不大。但裸卵经孤雌激活后，囊胚发育率将大幅提升，可有效增加囊胚的产出数，具有在一定利用价值。相比裸卵，透明状COCs的可利用率更低，虽然也拥有COCs的形态，但不能正常受精，体外受精48 h时观察，基本均已退化完毕。因此，透明卵在试验中可不做选择。在受精卵的体外培养方面，试验探究了在培养液CR1aa中添加10% FBS的使用效果。结果显示，CR1aa与加入10% FBS的CR1aa进行胚胎培养得到的卵裂率和囊胚率差异均不显著，与前人相关报道结果不一致[18-19]。分析认为原因可能是试验所用FBS产品与其他试验不同，导致效用可能存在较大差异；此外，体系所用受精液也含有血清成分，可能降低了FBS的使用效果。结果表明，本试验所用FBS在本体系中使用效果并不显著。但不同产品的功能差异较大，至于本体系是否可用其他产品进一步优化，仍有待更多研究。试验还尝试了子宫角表皮细胞共培养的使用效果，但卵裂率和囊胚率均未得到显著提高。子宫角为牛桑囊胚胎发育的场所，理论上其上皮细胞与受精卵的发育存在一定关联。但本试验结果仅在卵裂率方面表现出数值上的优势，与前人试验存在差异[7-10]。鉴于子宫角表皮细胞在卵裂率方面的优势，分析认为，子宫角表皮细胞在牛受精卵的体外发育方面具有潜在促进功能，而试验中细胞单层的制作相对比较简单，与前人试验不同，这可能是导致结果不一致的原因所在。此外，在子宫细胞相关试验方面，有试验对子宫内膜细胞在牛囊胚孵化方面的作用进行了研究，囊胚孵化的效果显著[20]。因此，子宫角表皮细胞的效能也可能主要表现在牛桑囊胚胎的后续发育方面[21]，前期效果不太明显，但具体结果还需进一步研究。4结论牛体外胚胎生产体系的优化是一项复杂的工程。本试验结果表明，裸卵在生产可移植受精胚胎方面的应用意义不大，但可应用于体外受精胚胎和孤雌激活胚胎等生产。透明状的COCs不仅难以体外受精，且容易退化，不适合生产应用。试验所采用10% FBS和子宫角表皮细胞共培养方法并不适合本体系的优化，其卵裂效果和囊胚发育率均无显著提升。