从琥珀酸脱氢酶、过氧化氢酶、谷氨酸分组酶、单胺氧化酶等生物酶中提取三硝基丙酸具有不同程度的抑制作用，进而阻断呼吸链和三羧酸循环的进行，导致细胞和组织器官缺氧、减少生成，最终使细胞和组织产生氧化损伤。此外，三硝基还能激活细胞膜中的还原型辅酶，激活能够导致分子氧被活化，从而引起大量活性氧自由基的生成。可能导致生物体氧化应激的自然因素很多，可以归纳为内源和外素。此外，氧化应激产生与许多其他因素有关，如生活方式和饮食习惯等。强大的物理活性、抗生素或抗癌药物的给药、过量的阳光（紫外线辐射等）和食物中缺乏营养物可能导致氧化应激，如缺乏维生素、铜。因此，有可能在细胞中产生过多的活性氧基，导致细胞内生物大分子如脂质、蛋白质和核酸的氧化损伤。山奈酚可通过其抗氧化活性和抗凋亡功能保护氧化应激人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞损伤，且山奈酚在预防和治疗由氧化应激介导的青光眼、年龄相关性黄斑变性（AMD）或其他视网膜疾病中具有潜在作用[1]。此外，山奈酚还可以保护内脏，对血管增殖与扩张等有明显作用，有抗菌抗病毒和解痉等作用[2]。但对山奈酚的抗氧化作用研究较少。试验证明，山奈酚的抗氧化作用，为减少氧化应激反应奠定基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物采用4~5周龄的昆明小白鼠42只，公、母鼠各21只，并饲养在人工控温室（26 ℃）下，自由采食饮水。光照期为12 h（8：00~20：00），黑暗期为12 h（20：00~8：00）。1.1.2药品试剂山奈酚购自成都瑞芬思生物科技公司；氯化钠（NaCl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、乙醇、冰醋酸、氢氧化钠（NaOH）均购自Sigma上海分公司；三硝基丙酸（3-NPA）购自上海博钰生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）溶液、聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白浓度测定试剂均购自碧云天生物技术研究公司；过氧化氢酶（CAT）试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。1.1.3仪器生物超净工作台（BCM-1000）购自上海苏净实业有限公司；低温高速离心机（5428DN319706）购自德国Eppendorf公司；漩涡震荡仪（MX-4）购自海门其林贝尔公司；漩涡混合器（XW-80A）购自海门其林贝尔公司；酶标仪（multiscan MK3）购自Thermo公司；台式微量高速离心机（hitachi CT15RE）购自德国Eppendorf公司；台式pH值测量仪（orion 3star）购自Thermo Scientific公司；电热智能恒温水浴锅（HW.SY11-KP3）购自明克斯仪器有限公司。1.2试验方法1.2.1试验分组及处理将42只小鼠两两配对，分为对照组、氧化应激模型组和抗氧化剂组。氧化应激模型建立的操作程序是：每天给予小鼠2次腹腔注射3-NPA（12.5 mg/kg）0.1 mL，间隔12 h（8：00、20：00）。每天间隔0.5 h（20：30）给予小鼠1次腹腔注射山奈酚（50 mg/kg）0.1 mL。生理盐水适量被注入空白对照组7 d。母鼠见栓起妊娠第20 d剖出幼鼠并取心、肝、肺。将组织冲洗并吸干水分，分别取1 g剪碎，加9 mL生理盐水配置成匀浆，再以3 000 r/min离心15 min，上清液即是10%的组织匀浆。1 mL的10%组织匀浆加9 mL生理盐水，即可配成1%的组织匀浆，两种匀浆均在-20 ℃下保存备用。1.2.2创建氧化应激模型将从实验中心取回的小鼠在实验室饲养，保持实验室室内空气清洁，使小鼠适应环境以减少应激。一周之后对小鼠腹腔注射3-NPA，1日2次，注射7 d。对照组小鼠注射同剂量的生理盐水，抗氧化剂组小鼠注射3-NPA＋山奈酚，每次给药剂量控制在0.1 mL，每次注射之后对小鼠观察至少1 h。1.2.3抗氧化酶活性检测采用相关试剂盒检测组织T-SOD、GSH-Px、CAT活性、T-AOC，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。1.2.4数据统计与分析采用SPSS 17.0进行统计学分析，试验数据以“平均值±标准误”表示，采用单因子方差分析（One-way ANOVA）中Duncan氏多重比较检验进行显著性分析，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1山奈酚对胎儿小鼠组织器官中过氧化氢酶（CAT）活力的影响（见表1）由表1可知，山奈酚组小鼠的肝脏和肺脏中CAT活性显著低于模型组（P0.05）。各处理组之间小鼠心脏的CAT活性无显著性差异（P0.05）。试验结果表明，山奈酚对子代胎鼠肝脏和肺脏中CAT活力有一定的恢复效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.014.T001表1山奈酚对胎儿小鼠组织器官中过氧化氢酶（CAT）活力的影响项目肝肺心对照组16.24±2.47a18.21±0.89a9.84±0.31模型组29.60±2.46b26.50±3.40b15.82±5.83山奈酚组17.56±2.70a20.53±2.57a10.99±2.57注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同字母表示差异不显著（P＞0.05）；下表同。U/mg prot2.2山奈酚对胎儿小鼠组织器官中总抗氧化能力（T-AOC）的影响（见表2）由表2可知，山奈酚组小鼠的肝脏、肺脏中T-AOC显著高于模型组（P0.05），心脏与对照组相比无显著性差异（P0.05）。试验结果表明，山奈酚恢复了由三硝基丙酸诱导的子代胎鼠的肝脏和肺脏中的T-AOC下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.014.T002表2山奈酚对胎儿小鼠组织器官中总抗氧化能力（T-AOC）的影响项目肝肺心对照组4.55±1.01b2.97±0.82b3.37±0.17b模型组3.90±0.08a1.47±0.30a1.56±0.07a山奈酚组4.20±1.87b2.23±0.01b2.73±0.37abU/mg prot2.3山奈酚对胎儿小鼠器官中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的影响（见表3）由表3可知，山奈酚组小鼠的肝脏、肺脏中GSH-Px活力显著低于模型组（P0.05），在心脏中GSH-Px的活力无显著性差异（P0.05）。试验结果表明，山奈酚缓解了由三硝基丙酸诱导的GSH-Px活力的升高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.014.T003表3山奈酚对胎儿小鼠器官中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的影响项目肝肺心对照组8.10±1.77a4.56±0.06a10.60±8.23模型组11.64±1.11b8.46±4.19b15.75±13.34山奈酚组6.64±0.23a3.07±1.29a12.06±8.00U/mg prot2.4山奈酚对胎儿小鼠组织器官中总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的影响（见表4）由表4可知，山奈酚组小鼠的肝脏、肺脏、心脏中T-SOD活力显著低于模型组（P＜0.05），与对照组之间差异不显著（P0.05）。试验结果表明，山奈酚缓解了三硝基丙酸导致的T-SOD活力的升高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.014.T004表4山奈酚对胎儿小鼠组织器官中总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的影响项目肝肺心对照组19.85±1.32a50.96±9.46a46.23±8.71a模型组26.61±3.84b78.91±12.71b60.81±2.04b山奈酚组19.22±1.48a48.69±21.12a46.82±4.03aU/mg prot2.5山奈酚对胎儿小鼠组织器官中丙二醛（MDA）含量的影响（见表5）由表5可知，山奈酚组小鼠的肝脏、肺组织、心脏中MDA含量显著低于模型组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.014.T005表5山奈酚对胎儿小鼠组织器官中丙二醛（MDA）含量的影响 单位：μmol/g prot项目肝肺心对照组1.76±0.07a1.61±0.08a7.67±3.70a模型组2.07±0.16b1.97±0.26b8.21±1.00b山奈酚组1.34±0.29a1.18±0.41a7.78±3.65a3讨论山奈酚可通过其抗氧化活性和抗凋亡功能保护氧化应激人RPE细胞损伤，山奈酚在预防和治疗由氧化应激介导的AMD或其他视网膜疾病中具有潜在作用。山奈酚还能根据mTOR、FoxO和AMPK/Nrf 2/HO-1等通路，减少氧化应激的有害影响，进一步保护细胞。但是，关于山奈酚的抗氧化作用的报道比较少。试验用三硝基丙酸分别对公、母鼠建立氧化应激模型与注射山奈酚以证明山奈酚具有一定的抗氧化作用，为山奈酚的临床应用和深入研究提供参考。过氧化氢酶（CAT）是一种可将H2O2分解为H2O和氧气的酶类清除剂，可防止H2O2的积累，阻止其产生毒害作用，是生物防御体系的关键的酶之一[3]。过氧化氢酶分布十分广泛，如植物的线粒体和内质网，以及动物的红细胞和肺脏，肝脏，心脏中等。过氧化氢酶具有的酶促活性可以使机体具有抗氧化的作用[4]。总抗氧化能力（T-AOC）可以反映机体的抗氧化的能力及机体氧化还原的整体状态，所以测定T-AOC的活力对研究机体抗氧化活性至关重要[5]，在试验中，肝脏、肺组织中山奈酚组的T-AOC活力高于模型组。本试验结果表明，山奈酚恢复了对子代胎鼠的肝脏和肺脏中的T-AOC的活力。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）在体内广泛存在，是可以清除自由基活性氧的重要的过氧化物分解酶[6]。谷胱甘肽过氧化物酶可以促进过氧化氢的分解，可以控制脂质过氧化水平来保护细胞膜的结构和功能不会被氧化应激所损伤[7]。超氧化物歧化酶（SOD）是修复细胞的生物体的酶，它可以使系统内的自由基清楚，起到第一道防线的作用[8]，其可以使超氧化物通过歧化反应转化为O2和H2O2。当机体的细胞内氧自由基水平增加时，可以诱导超氧化物的生成从而增加其抗氧化活性[9]。因此，SOD含量可以反映出体内的自由基清除能力[10]。本试验结果显示，子代胎鼠的肝脏和肺脏山奈酚组的CAT、GSH-Px、T-SOD活力均显著低于模型组（P＜0.05）；心脏山奈酚组T-SOD活力显著低于模型组（P＜0.05）。子代胎鼠的肝脏、肺脏、心脏的山奈酚组T-AOC数值显著大于模型组（P＜0.05）。结果表明，山奈酚对子代胎鼠肝脏和肺脏器官中CAT活力有一定的恢复效果。丙二醇（MDA）是长链脂肪酸发生氧化作用后的终末产物，可以反映机体内氧化反应的高低[11]及组织和细胞内自由基的损害度。因此，MDA常被用作机体内脂质过氧化水平的量度[12]。本试验中，小鼠肝脏、肺组织、心脏中山奈酚组的MDA含量显著低于模型组（P＜0.05），与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。由此可见，3-NPA处理可以提高胎鼠器官中抗氧化物酶的活力。抗氧化物酶的含量的增高可能是由于引起了小鼠体内的某种抗氧化机制从而产生了与之相关的抗氧化酶从而来对抗外界的氧化损伤，起到对器官的保护作用。山奈酚可以和活性自由基反应[13]，主要是由于它含有3、4'、5和7位羟基[14]，进一步实现自由基清除[15]。研究发现，存在酚羟基结构的化合物可以有效地清除氧自由基，并且随着酚羟基含量越多，效果越发明显[16]。同时，O-H键的强度和清除自由基的能力存在正比关系[17]。因为山奈酚的3、5和7位是酚羟基，7位羟基的酸性很强，因此山奈酚容易和金属离子反应，进一步增加其抗氧化活性[18]。本试验采用腹腔注射山奈酚的方法对小鼠亲代进行处理，发现子一代小鼠的肝脏和肺脏中各氧化反应相关酶的活性有明显改善，这与之前所研究的关于山奈酚具有抗氧化作用的结论一致[19]，证明山奈酚具有抗氧化的作用，并且对于子一代的胎鼠内氧化应激也有一定的影响。但是，山奈酚对机体的抗氧化机理还需要进一步的探究。4结论山奈酚具有抗氧化作用，可以改善氧化应激条件下子代胎鼠肝脏和肺脏中CAT、SOD、GSH-Px、T-AOC氧化应激酶的活力和MDA含量，并改善心脏中SOD的活力。