猪流行性腹泻病（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起一种以腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征的高度接触性的猪肠道传染病[1]。近几年来，猪流行性腹泻在我国冬春季节频发，给养猪业带来巨大的损失[2-3]。在临床上猪流行性腹泻病与传染性胃肠炎（TGE）以及猪轮状病（GAR）极为相似[4]，很难鉴别。现针对吉林省某养猪场病例，结合临床进行实验室科学检查、鉴别，最终确诊，为猪流行性腹泻病的诊断及治疗提供参考。1材料与方法1.1病料来源2头病（死）猪为吉林省某养猪场送检的发病仔猪。无菌采取心血、心包积液、淋巴结和肠道等实质器官用于病原分离与检验。1.2流行病学调查与临床症状收集针对该疫病的暴发，进行实地流行病学调查和临床观察。流行病学调查的主要内容包括：发病数量、猪群的免疫情况、发病情况、发病病程和治疗情况、周围地区发病情况等。同时现场观察、记录发病猪的临床症状[5]。1.3病理剖检对送检病死仔猪尸体进行病理剖检，观察该动物的皮肤颜色、口鼻肛门等天然孔变化，检查口腔和眼黏膜、皮下、肌肉、主要淋巴结和体腔积液与渗出情况，检查内脏器官肺脏、心脏、肝脏、肾脏、脾脏的病变和胃肠内容物性状与胃肠道黏膜系统的病理变化，并做好记录。同时，采取病料，保存于福尔马林溶液中，进行病理组织学检查病料。用于分子生物学检查的病料，保存于-80 ℃冰箱中备用。1.4病理组织学检查病理组织切片的制作采用常规方法与程序，即甲醛溶液固定后的组织以梯度乙醇溶液脱水，之后以二甲苯溶液进行透明处理，浸蜡包埋。包被块切片后按照先前报道方法进行HE染色与观察[6]。1.5样品处理以灭菌的棉拭子采集病仔猪肠道内容物，放入1 mL PBS中（100 mmol/L PBS，pH值7.2）4 ℃静置15 min，然后8 000 r/min、4 ℃离心20 min。上清液分装至Ep管，每管0.5 mL，-80 ℃冰箱保存备用[6]。1.6病毒感染细胞试验（CPE）肠内容物用含1 000 IU/mL青霉素、1 000 μg/mL链霉素PBS制成5倍悬液，在4 ℃条件下3 000 r/min离心30 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，将过滤液大约为病毒培养液的10%接种于长满Vero细胞单层上，同时加过滤液量50%的病毒培养液，37 ℃吸附1 h，添加至病毒培养液总量，置于37 ℃温箱培养，逐日观察3~4 d，对比CPE变化情况[7-8]。1.7总RNA提取将上述处理好的病毒培养细胞液样品进行处理，提取细胞总RNA。提取RNA鉴定后-80 ℃冰箱保存备用[9]。1.8引物设计依据GenBank收录的基因序列，分别设计猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、轮状病毒各1对引物，共3对特异引物[10]。按说明将引物稀释到备用浓度，-20 ℃保存备用。所用引物由上海生工生物公司合成，引物序列见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.006.T001表1引物序列Tab.1Primer sequence引物序列（5'—3'）PEDV S基因上游引物TTCTGAGTCACGAACAGCCAPEDV S基因下游引物CATATGCAGCCTGCTCTGAATGEV S基因上游引物GTGGTTTTGGTYRTAAATGCTGEV S基因下游引物CACTAACCAACGTGGARCTAGAR S基因上游引物AAAGATGCTAGGGACAAAATTGGAR S基因下游引物TTCAGATTGTGGAGCTATTCCA1.9反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）提取RNA按说明书进行cDNA的合成。PCR扩增参照TaKaRa 公司试剂说明书进行，总反应体系为25 μL。PCR反应程序为如下：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃, 30 s，共32个循环；72 ℃，10 min；PCR后的产物置于4 ℃。PCR产物以1%的琼脂糖进行电泳分析鉴定。2结果与分析2.1发病猪的流行病学调查结果吉林农安养殖户，养殖数量为100头仔猪，均为育肥用，日龄为60 d左右。仔猪均从一家猪场购进，购进18 d后发病。几乎全部发病，发病第4 d于2019年4月12日来门诊就诊。仔猪没有接种过猪流行性腹泻及猪传染性胃肠炎疫苗。用大量抗生素治疗无效，死亡7头。发病前没有更换饲料，近期气候变化大。本地猪流行性腹泻发病情况比较严重。2.2发病猪的临床症状患病猪主要表现为食欲减退、拉黄色水样稀粪便、步态不稳、被毛脏乱、精神状态差、体温稍高。时有粪便呈粥状、或为灰白、淡黄、黄绿、常混有黏液，甚至黏膜或血液。脱水严重、眼球下陷、皮肤弹力下降、鼻镜干燥等。2.3发病猪的剖检病理变化（见图1）由图1可知，患病猪病理剖检变化主要集中在小肠、结肠、盲肠有出血等变化。肠管扩张膨胀，肠壁菲薄透明，肠系膜充血、淤血、出血，外观整个肠管呈红紫色。肠系膜淋巴结水肿发白。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.006.F001图1发病猪的剖检病理变化Fig.1Necropsy pathological changes of diseased pigs（a）小肠浆膜潮红 （b）淋巴结肿大呈暗红 （c）小肠内黄色泡沫样内容物 （d）小肠黏膜出血、瘀血2.4发病猪的组织病理学结果（见图2）由图2可知，小肠绒毛脱落严重，小肠绒毛萎缩、肠绒毛与肠腺长短比例由正常的7∶1下降到3∶1以下，肠壁血管淤血出血等。脾脏动脉周围淋巴鞘增厚。肠系膜淋巴窦间隙增宽，水肿。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.006.F002图2组织病理学结果Fig.2Histopathological results（a）肠绒毛脱落 （b）小肠绒毛萎缩 （c）肠绒毛脱落 （d）肠淋巴窦间隙增宽、水肿2.5发病猪的CPE试验结果（见图3）Vero细胞复苏传代后观察正常形态，病毒感染后Vero细胞培养第40 h观察细胞病变。由图3可知，细胞表面粗糙、颗粒增多、有多细胞核细胞、可见空斑样小区、细胞逐渐脱落。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.006.F003图3CPE试验结果Fig.3Experimental result of CPE（a）CPE细胞病变 （b）正常Vero细胞对照2.6病毒基因扩增与鉴定结果（见图4）由图4可知，用凝胶成像进行鉴定扩增片段大小，结果可见TGEV和GARV对应引物没有出来目的条带，只有PEDV引物出现790 bp目的条带。说明此次检测样品的PEDV病原为阳性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.006.F004图4RT-PCR凝胶鉴定结果Fig.4Gel identification results注 ： M为2000Marker；1为TGEV S基因扩增产物；2为GARV S基因扩增产物；3为PEDV S基因扩增产物。3讨论本试验对吉林省某猪场暴发的一种临床上以水样腹泻为主要临床特征，发病率达100%。剖检主要以小肠和结肠有出血、肠管扩张膨胀、肠壁菲薄透明、肠系膜充血、淤血、出血为病变特征的疫病进行深入研究。通过病理组织学观察，发现小肠绒毛脱落严重、小肠绒毛萎缩明显、肠系膜淋巴结水肿间隙增宽等。病毒分离CPE试验结果提示，感染PEDV的Vero细胞表面粗糙、颗粒增多、细胞逐渐脱落。进一步RT-PCR试验鉴定结果显示，PEDV引物出现790 bp目的条带，而TGEV和GARV对应引物没有出来目的条带，可确定PEDV病原为阳性。所以，此次疫情是猪感染PEDV引起的猪流行性腹泻疫病。由此可见，病原的分离鉴定是实验室诊断的金标准。此病案发病在春季4月份，仔猪以水样腹泻为主、脱水严重、发病率高。由病毒引起的猪腹泻病原比较常见的有猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PORV）3种。有报道称，其中PED病例数占46%，远高于TGE（15%）和POR（8%），同时也存在三者混合感染的病例占31%。猪流行性腹泻病的治疗无特效方案，控制该疫病以预防为主，同时加强饲养管理和生物安全措施。目前，市面上有PED-TGE二联苗有一定预防效果，但又因为病毒变异用疫苗预防效果差，有研究采用强毒返饲的方法也收到很好地净化猪群PED效果。4结论此次吉林省某猪场暴发的腹泻，临床上以水样腹泻为主，发病率达100%。剖检病理变化以小肠和结肠黏膜充血、出血、肠管扩张膨胀、肠壁菲薄透明为特征的疫病，经病理组织学观察和病原分离鉴定，最终确诊该疫病为猪流行性腹泻。参 考 文 献[1] 刘旷，董加才，吴青，等.多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒方法的建立及应用[J].黑龙江畜牧兽医，2008（11）：56-58.[2] 李思银，杨亮宇，杨玉艾.猪流行性腹泻的实验室诊断方法[J].猪业科学，2010（12）：54-56.[3] 林志雄，黄引贤.应用直接免疫荧光法检测猪流行性腹泻病毒的研究[J].中国进出境动植检，1997（2）：32-34.[4] 赵雯雯，李敬双.猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立[J].黑龙江畜牧兽医，2010（3）：109-110.[5] 白文彬，于康震.动物传染病诊断学[M].北京：中国农业出版社，2002.[6] 何海健，吴瑗，王鲁彦，等.PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达[J].中国畜牧兽医，2019，46（3）：832-839.[7] 郭楠楠.PEDV细胞适应株全基因组序列测定与分析和抗N蛋白高免血清的制备[D].南昌：江西农业大学，2018.[8] 李树根，李力复，李力施，等.猪流行性腹泻病毒的分离及适应传代细胞培养病毒株的建立[J].中国畜禽传染病，1993（6）：1-5.[9] 冯蕊.猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其基因组测序分析[D].哈尔滨：东北农业大学，2018.[10] 楚丽丽.猪流行性腹泻病毒陕西分离株的鉴定及全基因组序列分析[D].杨凌：西北农林科技大学，2018.