乳清是制造干酪和干酪素时排除的副产物，含有乳糖、乳清蛋白等营养成分[1-2]，可以作为微生物培养基和饲料添加剂。乳清中的乳糖经肠道有益菌发酵后形成的乳酸和丁酸，能够降低肠道pH值，从而抑制其他有害菌、致病菌繁殖。乳清中的乳清蛋白具有缓解疲劳、抗氧化以及免疫调节作用，乳清中的乳铁蛋白具有促进铁的吸收、调整瘤胃微生物、抗病毒、抑菌作用[3-5]。乳清作为饲料添加剂在动物生产中应用已有报道。李嘉等[6]研究表明，在日粮中添加一定量的乳清粉，能够明显提高断奶仔猪的体重，提高饲料报酬，从而提高养殖经济效益。王明琼等[7]研究发现，在饲粮中加入一定量牛乳能够促进藏仔猪的生长发育。Geiger等[8]研究表明，乳清型初乳喂养犊牛具有较好的生长性能。于晓晨等[9]研究发现，乳清蛋白肽对衰老模型小鼠具有改善抗氧化功能和学习记忆的作用。益生菌可以调节动物肠道菌群，提高机体免疫功能，从而提高动物的生产性能。研究发现，双歧杆菌可以提高哺乳仔猪的生长性能，降低腹泻率和死亡率[10]。副干酪乳杆菌可显著提高蛋鸡的生产性能，降低鸡蛋中胆固醇含量[11]。副干酪乳杆菌可提高杂交鸡的平均日增重，提高肠道菌群菌落多样性及丰度[12]。植物乳杆菌、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）以及鼠李糖乳杆菌活菌冻干剂及其发酵上清液对子宫内膜炎具有较好的治疗效果[13]。因此，乳清及益生菌在动物生产中具有广泛的应用价值，经益生菌发酵后的乳清具有更高的生物活性。本研究以副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌为研究对象，在其培养基中加入不同含量的乳清，测定培养后益生菌的活菌数、pH值以及生成有机酸含量，分析乳清对益生菌生长代谢的影响，为乳清在益生菌中的应用及发酵乳清在饲料工业中的利用提供参考。1材料与方法1.1材料和试剂乳清、副干酪乳杆菌（LPC-37）、动物双歧杆菌（BB-12）、鼠李糖乳杆菌（LGG），均由吕梁学院生命科学系保存。蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸氢二铵、乙酸钠、琼脂粉、硫酸镁、硫酸锰、吐温80、菊粉等均为分析纯。1.2试验仪器FE20K型pH计购自梅特勒中国（上海）有限公司，DHP-9032电热恒温培养箱购自上海冉绘电热恒温培养箱，A-701低速离心机购自得利特北京科技有限公司，BKQ-B50L压力蒸汽灭菌锅购自济南鑫贝西生物技术有限公司，J-2菌落计数器购自江苏天翎仪器有限公司，U3000高效液相色谱仪购自赛默飞世尔科技。1.3培养基的配制MRS液体培养基：4.0 g酵母膏、蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0 g、葡萄糖20.0 g、硫酸镁0.2 g、磷酸氢二钾2.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、硫酸锰0.04 g、吐温80 1.0 g、水1 L，充分溶解，121 ℃灭菌20 min。MRS固体培养基：在MRS液体培养基中加入琼脂12.0 g。1.4试验设计副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌分别在加入2%葡萄糖的MRS培养基、5%、10%、15%乳清的MRS培养基、2%菊粉的MRS培养基中进行培养，培养24 h后测定相关指标。1.5测定指标及方法1.5.1菌落总数测定参考文献[14]至文献[15]方法测定细菌总数。取样液1 mL加入9 mL灭菌的蒸馏水中混匀后取1 mL再加入灭菌的9 mL蒸馏水中，之后依次梯度稀释，取10-7、10-8、10-9稀释液各1 mL于培养皿中，加入融化的MRS培养基混匀后倒置于恒温培养箱中37 ℃培养72 h后进行计数。1.5.2pH值参照GB/T 9695.5—2008的方法，对培养24 h的菌液分别测定其pH值。1.5.3有机酸[16-17]采用HPLC法测定有机酸含量。取不同处理的样液4 ℃、4 000 r/min离心20 min，取上清液，过0.22 μm水膜，上机检测。Accucore C 18 反向色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱温30 ℃，0.015 mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈溶液（pH值2.7）作为流动相，20 μL进样量，0.8 mL/min流速，210 nm下紫外检测。利用各标准品进行比对，计算各有机酸的相对含量。1.5.4抗氧化能力1.5.4.1ABTS自由基清除能力参考文献[18]的方法并做一定的修改。7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾混匀，避光放置24 h形成ABTS储备液，使用0.1 mol/L PBS（pH值7.4）稀释，测定其在734 nm处吸光值为0.70。取2.5 mL发酵液，加入5 mL的ABTS稀释液，充分混匀，暗处反应6 min，734 nm下测定吸光值。ABTS自由基清除率=1- As-AcAb×100%（1）式中：AS为样品吸光值；AC为对照组吸光值，即使用同体积PBS代替ABTS稀释液；Ab为样品空白组吸光值。1.5.4.2DPPH自由基清除能力参考文献[19]的方法并进行调整。将2.5 mL发酵液与5 mL 0.1 mmol DPPH充分混匀，20 ℃避光反应30 min，期间不断振荡，4 000 r/min离心5 min，测定上清液在517 nm的吸光度。DPPH自由基清除率=1- As-AcAb×100% （2）式中：AS为样品吸光值；AC为对照组吸光值，即用同体积无水乙醇代替DPPH；Ab为样品空白组吸光值。1.6数据统计与分析试验数据采用SAS 9.0软件进行整理分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1乳清对益生菌的菌落数的影响（见表1）菌落总数是指在一定条件下每克或每毫升平板上长出的微生物菌落的总数，每个细菌均可形成一个可见菌落，可反映培养液中微生物的密度。由表1可知，与葡萄糖和菊粉相比，添加10%和15%乳清副干酪乳杆菌的菌落数显著增加（P0.05）。与菊粉相比，添加5%、10%、15%乳清鼠李糖乳杆菌菌落数显著增加（P0.05）。各乳清组动物双歧杆菌的菌落数显著高于葡萄糖和菊粉（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.019.T001表1乳清对益生菌的菌落数的影响益生菌2%葡萄糖2%菊粉5%乳清10%乳清15%乳清副干酪乳杆菌（LPC-37）8.24±0.35b8.52±0.33b8.58±0.28b9.15±0.32a9.17±0.24a鼠李糖乳杆菌（LGG）8.68±0.27b8.02±0.28c8.87±0.32b9.07±0.36a9.12±0.28a动物双歧杆菌（BB-12）8.08±0.31b8.15±0.29b9.21±0.31a9.14±0.26a9.27±0.32a注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。CFU/mL2.2乳清对益生菌pH值的影响（见表2）由表2可知，当乳清添加量为5%时，各益生菌发酵液的pH值均较高，其中添加5%乳清的副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌的pH值显著高于2%菊粉、15%乳清（P0.05）；2%葡萄糖和10%乳清差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.019.T002表2乳清对益生菌pH值的影响益生菌2%葡萄糖2%菊粉5%乳清10%乳清15%乳清副干酪乳杆菌（LPC-37）4.24±0.35a3.94±0.33b4.51±0.28a4.16±0.32a3.83±0.24b鼠李糖乳杆菌（LGG）4.10±0.274.54±0.284.62±0.324.32±0.364.09±0.28动物双歧杆菌（BB-12）4.22±0.31a3.97±0.29b4.37±0.31a4.17±0.26a3.84±0.32b结果表明，乳清中的乳糖可以为益生菌利用发酵产酸，但不同益生菌利用这些底物的能力不同，因而代谢形成酸类物质的量不同，致使发酵的pH值不同。2.3乳清对益生菌抗氧化性的影响（见表3、表4）由表3可知，加入5%、10%乳清的副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌对ABTS自由基的清除率低于葡萄糖和菊粉，表明低浓度的乳清对益生菌抗氧化活性的影响较小。加入15%乳清后，副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌对ABTS自由基的清除率显著高于2%葡萄糖和2%菊粉（P0.05）；加入15%乳清后，动物双歧杆菌对ABTS自由基的清除率高于2%葡萄糖（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.019.T003表3乳清对益生菌培养24 h后ABTS自由基清除率的影响益生菌2%葡萄糖2%菊粉5%乳清10%乳清15%乳清副干酪乳杆菌（LPC-37）58.43±3.16b57.43±3.11b48.46±2.58bc50.35±2.26bc62.57±2.16a鼠李糖乳杆菌（LGG）63.46±2.10b64.37±2.58b55.37±2.54bc56.32±2.46bc66.35±2.57a动物双歧杆菌（BB-12）53.79±1.98c62.17±2.43a50.13±2.07c55.68±2.68c60.32±2.37b%由表4可知，与添加葡萄糖和菊粉相比，加入10%、15%乳清的副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的DPPH自由基的清除率显著提高（P0.05）；5%乳清鼠李糖乳杆菌的DPPH自由基的清除率显著提高（P0.05）。加入5%、10%、15%的乳清，鼠李糖乳杆菌对DPPH自由基的清除率显著高于2%葡萄糖和2%菊粉（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.019.T004表4乳清对益生菌培养24 h后DPPH自由基清除率的影响益生菌2%葡萄糖2%菊粉5%乳清10%乳清15%乳清副干酪乳杆菌（LPC-37）64.28±2.86c60.46±2.78c65.76±3.14bc70.26±2.86b82.15±3.89a鼠李糖乳杆菌（LGG）58.14±3.03c62.67±2.85c68.42±2.85b71.28±2.93b86.27±3.37a动物双歧杆菌（BB-12）62.28±2.68b63.11±2.69b61.58±2.43b63.12±3.16b71.28±2.89a%2.4乳清对益生菌培养24 h后生成丙酸、丁酸的影响（见表5）由表5可知，添加乳清后对副干酪乳杆菌生成丙酸、丁酸的影响不大，加入15%乳清后生成丙酸和丁酸分别为5.69和0.63 mg/L，显著低于菊粉（P0.05）。添加15%乳清后，鼠李糖乳杆菌发酵生成丙酸和丁酸含量显著高于2%葡萄糖（P0.05），分别达到5.14和0.31 mg/L。添加15%乳清后，动物双歧杆菌生成丙酸和丁酸的含量达到5.68和0.53 mg/L，显著高于2%葡萄糖和2%菊粉（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.019.T005表5乳清对益生菌培养24 h后生成丙酸、丁酸的影响项目益生菌2%葡萄糖2%菊粉5%乳清10%乳清15%乳清丙酸副干酪乳杆菌（LPC-37）5.23±0.57b6.21±0.55a4.68±0.76bc5.32±0.37b5.69±0.65b鼠李糖乳杆菌（LGG）2.69±0.87c5.32±0.38a2.27±0.49c3.68±0.29b5.14±0.39a动物双歧杆菌（BB-12）4.68±0.48b5.33±0.54a3.27±0.56c4.57±0.54b5.68±0.71a丁酸副干酪乳杆菌（LPC-37）0.57±0.03bc0.71±0.06a0.49±0.04c0.59±0.04bc0.63±0.07b鼠李糖乳杆菌（LGG）0.19±0.05c0.33±0.04a0.16±0.03c0.22±0.03b0.31±0.04a动物双歧杆菌（BB-12）0.27±0.05c0.49±0.05a0.22±0.04c0.33±0.05b0.53±0.07amg/L2.5乳清与益生菌相关性分析（见表6）由表6可知，5%浓度乳清与鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌呈显著正相关（P0.05），而10%乳清与3种益生菌均呈显著正相关（P0.05），15%乳清与3种益生菌呈极显著正相关（P0.01）。结果表明，添加15%乳清可促进益生菌增殖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.019.T006表6乳清与益生菌相关性分析益生菌5%乳清10%乳清15%乳清副干酪乳杆菌（LPC-37）0.6750.814*0.912**鼠李糖乳杆菌（LGG）0.721*0.821*0.903**动物双歧杆菌（BB-12）0.765*0.832*0.964**注：“*”表示显著相关（P0.05），“**”表示极显著相关（P0.01）。3讨论3.1乳清对益生菌菌落数的影响发酵的菌落数反映可以不同的益生元对益生菌的促生长作用，菌落数越高表明益生元对益生菌的促进效果越明显。本试验中，3种益生菌添加不同浓度乳清的菌落总数高于菊粉和葡萄糖，而菊粉是公认的益生元，表明乳清具有益生元的作用，促进了益生菌生长，这与乳清中含有的乳糖、乳清蛋白等主要营养成分有关。本试验中各乳清组动物双歧杆菌的菌落数均显著高于葡萄糖和菊粉，与藏传刚等[20]研究结果一致。综上，本试验条件下，添加15%乳清益生菌的营养物质含量更丰富，对益生菌的促进效果更好。3.2乳清对益生菌抗氧化能力的影响DPPH、ABTS自由基是常用评价抗氧化自由基，根据ABTS与抗氧化物质反应后体系褪色程度能够反映其抗氧化能力[21]。DPPH自由基的乙醇溶液呈紫色，当与抗氧化物质反应后其颜色降低，相应的特征吸收峰值降低，吸光值变小。因此，测定抗氧化物质在517 nm下吸光值能够反映抗氧化活性[22-23]。益生菌具有抗氧化性，益生菌的抗氧化机制有4种：清除活性氧、金属螯合离子、抑制酶活性、降低抗坏血酸自氧化活性和抑制其氧化[24]。益生菌的代谢活动可能具有抗氧化作用，主要是因为消耗氧，进而抑制了氧化反应发生以及氧化产物在肠道内生成。益生菌代谢产生的乳酸、细菌素、H2O2等具有抗氧化活性，益生菌代谢过程中产生的蛋白酶和肽酶对蛋白质降解后形成的多肽、氨基酸等也具有抗氧化作用[25]。乳清中也含有抗氧化成分，但不同益生菌代谢生成抗氧化物质的量及本身抗氧化能力不同，表明不同的菌种对底物的吸收利用不同，因而不同益生菌发酵后的抗氧化活性不同。本研究中，乳清对LPC-37和LGG发酵后的抗氧化活性影响较大，对BB-12的影响较小。原因是不同益生菌的代谢系统和代谢产生的酶系不同，利用乳清的能力不同，导致其生长繁殖以及代谢产物的形成不同，进而表现不同的抗氧化活性。与报道的L. acidophilus CSCC 2400、L. paracasei CSCC 279、L. zeae ASCC 15820 和L. rhamnosus WQ2发酵豆乳后L. rhamnosus WQ2的抗氧化活性最高的结论类似[26]。3.3乳清对益生菌pH值及产酸的影响pH值能够反映溶液中物质的变化。在菌液中，由于益生菌要进行生长繁殖等生命活动，会消耗培养基中的营养物质，产生乳酸等有机酸，使菌液pH值下降。因此可根据菌液酸碱度的变化判断益生菌活动能力。益生菌发酵后产物的pH值能够间接反映益生菌生长代谢的情况，一定时间内产酸越多表明益生菌生长繁殖越快。益生菌的益生作用包括益生菌本身在肠道的定植以及其代谢形成的产物，益生菌在肠道的黏附与很多因素有关，其代谢生成的短链脂肪酸对机体具有重要作用。其中乙酸在调节脂肪代谢、糖异生中具有重要作用，丙酸作为前体底物能够通过调节糖代谢预防肥胖和糖尿病，而丁酸被肠细胞吸收利用后，能够保护肠的正常功能，预防结肠癌[27-28]，因而益生菌在不同底物及环境下代谢生成的短链脂肪酸常被用来评价其益生作用。不同益生菌在乳清中发酵后形成的丙酸和丁酸含量不同，与不同益生菌在乳清中生长繁殖不同有关。乳酸菌发酵和贮藏期间生成的有机酸也是抗氧化活性增加的重要原因[29-30]，不同益生菌在乳清中发酵后抗氧化活性不同可能与其代谢生成的有机酸含量不同有关，具体原因有待进一步分析。4结论本试验中，培养基中加入乳清能够促进益生菌生长，提高抗氧化性，增加有机酸浓度，其中以添加15%乳清效果较好，可考虑利用乳清制作培养基，生产发酵乳清饲料。