近年来，随着水产养殖业的规模化、集约化发展，病毒病、细菌病、真菌病、寄生虫病等生物病原性病害高频暴发。弧菌病是鱼类、虾类、蟹类和贝类养殖最常见的病害，主要致病原有副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、鳗弧菌等[1-2]。生产中过度使用抗生素导致弧菌耐药性问题日趋严重[3]，且弧菌的耐药菌株可以通过海产品进入人体，造成巨大的安全隐患[4]。因此，需要寻找、开发绿色安全、高效的抗菌药物。诃子是使君子科植物诃子（Terminalia chebula Retz.）或绒毛诃子（Terminalia chebula Retz. var. tomentella Kurt）的成熟果实，含有鞣质类、酚酸类、黄酮类等多种成分，能够发挥抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、解毒、免疫调节等作用[5]。诃子对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、粪肠球菌、变形链球菌、白色念珠菌等具有广谱抗菌作用[6]。诃子与虎杖、紫花地丁、黄芩、黄连、五倍子、石榴皮等中草药联用可对鸡白痢沙门氏菌[7]、罗非鱼源无乳链球菌[8]、铜绿假单胞菌[9]、变形假单胞菌[10]起抗菌作用；有效防治犊牛大肠杆菌病[11]、奶牛子宫内膜炎等[12]。诃子叶中含有与果实类似的化学成分，如诃子酸、诃黎勒酸等[13]。鉴于诃子的优良抗菌性能，本研究测定诃子叶不同溶剂提取物对致病性弧菌的体外抑菌活性，初步分析诃子叶提取物的抗菌作用机制，为其作为新的抑菌剂及资源开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料诃子叶采自云南省临沧市永德县，经广东药科大学中药学院李钟副教授鉴定为使君子科植物诃子的叶。溶藻弧菌（ATCC 17749）、创伤弧菌（ATCC 27562）、拟态弧菌（GDMCC 802639）、河流弧菌（ATCC 33809）、哈维氏弧菌（ATCC BAA-1117）、副溶血弧菌（ATCC 17802）由广东省微生物研究所、中国水产科学研究院南海水产研究所提供。1.2试剂与仪器1.2.1主要试剂2216E液体培养基、2216E琼脂培养基均购自海博生物技术有限公司，0.5%无菌TTC溶液购自广东环凯微生物科技有限公司。碱性磷酸酶测试盒、BCA试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。1.2.2主要仪器SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台购自苏州净化科技设备有限公司，HPP110恒温培养箱购自德国美墨尔特有限公司，YX-280D手提式压力蒸汽灭菌器购自合肥华泰医疗设备有限公司，Synergy HTX酶标仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。1.3测定指标及方法1.3.1诃子叶提取物制备水提取物：将诃子叶粉碎为粗粉，准确称取诃子叶粗粉100 g于圆底烧瓶中，按料液比1∶10 g/mL加入水，加热回流提取2次，2 h/次，合并两次提取液，75 ℃减压浓缩至一定浓度，冷冻干燥，取0.1 mL浓度为1 g/mL的提取液，加入无菌水定容至1 mL，配制成100 g/L溶液。50%乙醇提取物：如上法制备50%乙醇提取物，称取0.1 mL浓度为1 g/mL的提取液，以含2%吐温-80、5%DMSO溶液为助溶剂配制成100 g/L的溶液。1.3.2菌悬液制备将-80 ℃保藏的菌种于2216E琼脂培养基上划线，36 ℃培养20 h，挑取1~2个菌落于2216E液体培养基中，36 ℃振荡培养6~8 h，以麦氏比浊管比对，使用2216E液体培养基稀释成浓度为2.0×106 CFU/mL的悬菌液。1.3.3诃子叶提取物的体外抗菌活性1.3.3.1抑菌环直径测定采用K-B纸片法[14]，分别吸取10 μL浓度为1.0 g/mL的诃子叶水提取物溶液、50%乙醇提取物溶液至直径为6.0 mm的无菌空白药敏片上，60 ℃烘干。吸取100 μL浓度为2.0×106 CFU/mL的菌悬液至2216E琼脂板上，涂布均匀，放上诃子叶提取物药敏片，36 ℃培养20 h取出，使用游标卡尺测量抑菌环直径。评价标准：20 mm为极敏感，15~20 mm为高度敏感，10~15 mm为中度敏感，6~10 mm为低度敏感，≤6 mm为不敏感。1.3.3.2MIC和MBC的测定采用微量肉汤二倍稀释法[14]，取96孔细胞培养板，在横排每孔中加入100 μL的2.0×106 CFU/mL菌悬液，吸取100 g/L诃子叶水提取物溶液或100 g/L的50%乙醇提取物溶液100 μL于96孔细胞培养板的横排第1孔中，混匀，吸取100 μL混合液至第2孔中，依次进行倍比稀释至第11孔，使孔中诃子叶提取物终浓度依次为50.000、25.000、12.500、6.250、3.130、1.560、0.780、0.390、0.200、0.098、0.049 g/L；第12孔加入100 μL无菌生理盐水作为空白对照。加样后，将96孔板置于培养箱中36 ℃培养20 h，每孔加入0.5%无菌TTC溶液进行显色，以颜色不变者对应药物浓度为MIC值，试验平行3次。选取药物浓度为2MIC及MIC孔，吸取50 μL孔中培养液至2216E琼脂板上，涂布均匀，36 ℃培养20 h。以无菌生长者为MBC，试验平行3次。1.3.4诃子叶提取物的抗菌作用机制研究根据体外抑菌活性结果，选取溶藻弧菌为代表菌株，对诃子叶水提物的抗菌作用机制进行初步研究[15-16]。1.3.4.1诃子叶提取物对溶藻弧菌细胞壁通透性的影响设置诃子叶水提物组、空白菌液对照组。诃子叶水提物组：在无菌试管中分别加入2MIC诃子叶水提物溶液和2.0×106 CFU/mL的溶藻弧菌菌悬液各1 mL，混匀，使诃子叶水提物溶液终浓度为MIC。空白菌液对照组：在无菌试管中加入无菌生理盐水和2.0×106 CFU/mL的溶藻弧菌菌悬液各1 mL，36 ℃振荡培养12 h，每隔3 h将菌体培养液取出，3 500 r/min低温离心15 min，取上清液，按照碱性磷酸酶试剂盒说明书进行操作，于酶标仪中测定520 nm处吸光度值，计算AKP活力，以时间为横坐标、AKP活力为纵坐标绘制曲线，分析MIC浓度的诃子叶水提物在不同作用时间对溶藻弧菌细胞壁通透性的影响。1.3.4.2诃子叶提取物对溶藻弧菌细胞膜的影响设置诃子叶水提物组、空白菌液对照组。诃子叶水提物组：在无菌试管中分别加入一定浓度的诃子叶水提物溶液和2.0×106 CFU/mL的溶藻弧菌菌悬液各1 mL混匀，使诃子叶水提物溶液终浓度为MIC。空白菌液对照组：在无菌试管中加入无菌水和2.0×106 CFU/mL的溶藻弧菌菌悬液各1 mL。于36 ℃振荡培养12 h，每隔3 h将菌体培养液取出，3 500 r/min低温离心15 min，取上清液，于酶标仪中测定260 nm下吸光度值，以时间h为横坐标、吸光度值OD260 nm为纵坐标绘制曲线，分析MIC浓度的诃子叶水提物在不同作用时间对溶藻弧菌细胞内核酸含量的影响。按照BCA试剂盒说明书进行操作，于酶标仪中测定波长562 nm吸光度值，计算蛋白浓度，以时间h为横坐标、以蛋白质浓度为纵坐标绘制曲线，分析MIC浓度的诃子叶水提物在不同作用时间对溶藻弧菌细胞内蛋白质含量的影响。1.4数据统计与分析采用SPSS 22.0进行方差分析及t检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1诃子叶提取物对致病性弧菌的体外抑菌活性（见表1）由表1可知，诃子叶水提取物对受试菌株的抑菌环直径为18.45~21.22 mm，MIC为0.78~3.13 g/L，MBC为0.78~6.25 g/L。诃子叶50%乙醇提取物对受试菌株的抑菌环直径为18.24~20.34 mm，MIC为0.78~6.25 g/L，MBC为1.56~12.50 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.016.T001表1诃子叶提取物对致病性弧菌的体外抑菌活性（n=3）受试菌株诃子叶提取物抑菌环直径/mmMIC/（g/L）MBC/（g/L）溶藻弧菌水提取物21.22±0.420.780.7850%乙醇提取物20.34±0.430.781.56创伤弧菌水提取物20.50±0.363.133.1350%乙醇提取物20.01±0.343.133.13拟态弧菌水提取物19.21±0.243.136.2550%乙醇提取物18.86±0.326.256.25河流弧菌水提取物18.60±0.431.563.1350%乙醇提取物18.24±0.251.563.13哈维氏弧菌水提取物20.59±0.390.781.5650%乙醇提取物20.25±0.441.563.13副溶血弧菌水提取物18.45±0.423.136.2550%乙醇提取物18.75±0.326.2512.50研究表明，诃子叶不同提取物对水产常见致病性弧菌表均现出高度的敏感性，抑制作用显著，对溶藻弧菌、哈维氏弧菌的抑菌活性最强，其中水提取物较50%乙醇提取物表现出更强的体外抗菌作用。2.2诃子叶提取物的抗菌作用机制2.2.1诃子叶水提取物对溶藻弧菌细胞壁通透性的影响（见表2）由表2可知，空白菌液对照组在3~12 h的培养时间内，培养液上清液的AKP活性均较低（0.18~0.29 U/L）；而经过MIC浓度的诃子叶水提取物作用后，菌体培养液中AKP活性随着作用时间（3~6 h）延长而升高（0.64~0.89 U/L），在3 h即表现出明显差异，6 h后基本趋于稳定，表现出良好的时间正相关性。主要是由于溶藻弧菌菌体细胞壁受破坏的程度越大，AKP的外泄就越多。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.016.T002表2诃子叶水提取物对溶藻弧菌细胞壁通透性的影响（n=3）组别AKP活性3 h6 h9 h12 h空白菌液对照组0.18±0.050.22±0.040.28±0.040.29±0.06诃子叶水提取物组0.64±0.07*0.88±0.08*0.92±0.06*0.89±0.02*注：“*”表示与空白菌液对照组相比差异显著（P0.05）；下表同。U/L2.2.2诃子叶水提取物对溶藻弧菌细胞膜的影响（见表3、表4）由表3、表4可知，在溶藻弧菌正常生长过程中，其培养液上清液在3~12 h的OD260 nm值变化范围为0.063~0.101、蛋白质含量变化范围为118.09~150.11 mg/L，表明其胞内的RNA/DNA核酸物质、可溶性蛋白质受到细胞膜保护，外排量很低；随着培养时间延长，个别细胞发生衰老死亡，因此二者的含量略有提高（P0.05）。而随着MIC浓度的诃子叶水提取物作用时间延长，溶藻弧菌的菌体细胞膜受破坏程度逐渐增大，引起胞内核酸、蛋白质等内容物泄露逐渐增多，且3 h后二者在胞外的含量明显上升。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.016.T003表3不同作用时间下的溶藻弧菌胞外OD260 nm值（n=3）组别OD260 nm值3 h6 h9 h12 h空白菌液对照组0.063±0.0110.081±0.0110.097±0.0070.101±0.008诃子叶水提取物组0.381±0.012*0.415±0.024*0.428±0.033*0.430±0.025*10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.016.T004表4不同作用时间下的胞外溶藻弧菌蛋白质含量（n=3） 单位：mg/L组别蛋白质含量3 h6 h9 h12 h空白菌液对照组118.09±8.82129.94±15.51135.77±9.98150.11±16.66诃子叶水提取物组382.87±7.53*392.15±7.29*410.42±12.11*411.57±15.57*研究表明，诃子叶水提取物能够有效破坏溶藻弧菌的细胞膜完整性而起抗菌作用。3讨论3.1诃子叶提取物的体外抗菌活性分析诃子水提取物在体外对鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性优于95%乙醇提取物[17]，对表皮葡萄球菌、粪肠球菌、藤黄八叠球菌的抗菌活性优于75%乙醇提取物[18]。本研究发现，诃子叶水提取物对溶藻弧菌、哈维氏弧菌的抗菌作用最强，诃子叶水提取物比50%乙醇提取物对拟态弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌的敏感度更高（抑菌环直径更大），抑菌活性更强（MIC、MBC更低），表现出更强的抗菌作用。研究表明，诃子叶和诃子果实的不同溶剂提取物具有类似的“量-效”抗菌规律，且诃子叶水提取物的整体抗菌性能更优。3.2诃子叶提取物对溶藻弧菌细胞壁的作用菌体细胞壁能够有效保护细胞正常形态与维持生长。本试验发现，在MIC浓度下，诃子叶水提取物作用于溶藻弧菌3 h，培养液中的AKP活性显著性升高，表明菌体的细胞壁已受明显破坏。研究发现，槲皮素作用于大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌后，菌体胞外渗出的AKP活性极显著增加；超微结构结果显示，细胞壁外的菌毛脱落，胞壁损伤出现孔隙，胞质内容物逐渐溶解泄漏出胞外，引起细胞空化死亡[19]。3.3诃子叶提取物对溶藻弧菌细胞膜的作用细胞膜是抵御外界攻击的有效屏障，可起到渗透屏障、物质转运和信号转导作用，为菌体细胞生长提供稳定的内环境。本试验发现，当诃子叶水提取物在MIC浓度下作用于溶藻弧菌3 h，培养液的核酸、可溶性蛋白质含量均明显提高，表明菌体的细胞膜已受到损伤。诃子中的没食子酸甲酯可破坏多种菌的细胞膜。Bag等[20]研究发现，没食子酸甲酯在0.7×MBC（64~256 mg/L）浓度下，可损伤耐氟喹诺酮霍乱弧菌细胞膜，造成细胞质内容物漏出膜外，引起细胞死亡，从而有效抑制细菌生长。因此，诃子叶水提取物在MIC浓度下作用3 h，能够明显破坏溶藻弧菌的细胞壁与细胞膜结构和功能的完整性，有效引起细胞内AKP、核酸、蛋白质的外渗和干扰菌体细胞内酶系统及遗传物质的正常代谢，诱导细胞死亡，从而有效抑制细菌生长。4结论诃子叶水提取物和乙醇提取物均对溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌具有广谱高效的抑菌作用，且对溶藻弧菌的抑制作用最强。诃子叶提取物可作为饲料添加剂或“替抗”植物源抑菌剂进行开发利用。