炎症性肠病（IBD）会导致胃肠道发生炎症，其发病率在南美洲、东欧、亚洲和非洲呈上升趋势[1]。溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病是IBD的两种形式，其中UC为主要形式。UC的主要临床特征为弥漫性炎症，患病样本会出现弥漫性黏膜颗粒、水肿和红斑，伴有或不伴有溃疡，这些黏膜变化包括直肠黏膜改变、近端结肠长度改变、远端结肠病变等[2]。患病机体通常表现为腹痛、腹泻、粪便带血等[3]。目前尚未完全掌握UC的发病机制，根据病变程度可分为全结肠炎、次全结肠炎、左侧结肠炎、溃疡性直肠炎[4]。外泌体是具有双层膜结构的纳米级囊泡[5]，可从T细胞、B细胞、上皮细胞、树状突细胞和肿瘤细胞等通过特定途径被分泌至细胞外[6]，参与细胞间物质运输与信息传递等功能[7]。研究表明，牛乳外泌体可作为“细胞信使”调节免疫反应[8]，抑制肿瘤基因或癌基因[9]，调节肠道屏障功能[10]和肠道微生物菌群平衡及代谢[11]。目前，关于牛乳外泌体的研究主要集中于提取、鉴定、疾病筛选和抗癌作用等方面[12]。本研究主要探讨牛乳外泌体对DSS诱导的结肠炎小鼠的调节作用，为进一步开发和研究结肠炎小鼠的治疗方法提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物21日龄11~13 g的SPF级雄性BALB/c小鼠由广东省实验动物中心提供，许可证号为SCXK（粤）2018-0002。1.1.2主要试剂葡聚糖硫酸钠（DSS），相对分子质量为36 000~50 000，由大连美仑生物技术有限公司提供；牛乳外泌体（1 g/L）由上海宇玫博生物科技有限公司提供。1.2试验设计42只小鼠适应性饲养6 d，随机分为3组，分别为对照组、模型组（DSS组）和牛乳外泌体组（Exo组），每组7个重复，每个重复2只。试验期12 d。试验期间对照组小鼠自由饮水；DSS组小鼠前5 d自由饮用3.5%的DSS溶液，后7 d自由饮水，Exo组小鼠前5 d自由饮用3.5%的DSS溶液，后7 d每只小鼠灌喂10 μL牛乳外泌体。1.3样品采集1.3.1血清采集试验期最后1 d，每组随机选取1只小鼠，使用眼球摘取法采集血液，静置1 h，3 000 r/min离心20 min，分离血清，-80 ℃保存。1.3.2结肠组织采集采血后断颈处死小鼠，取结肠中段约2 cm样品，使用PBS洗净，固定于4%甲醛缓冲溶液，用于制作切片。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验期开始及结束对每只小鼠进行称重，记录每组小鼠的日采食量，计算各重复小鼠的平均日增重以及平均日采食量。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=总采食量/试验天数(2)1.4.2疾病活动指数（DAI）评分试验期间每天记录小鼠的粪便性状、便血情况以及DAI评分。DAI评分标准[13]见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.018.T001表1DAI评分标准计分体重量下降率/%大便性状血便情况0无正常阴性11~5——26~10半稀便潜血311~15——415稀便肉眼血便注：正常大便为干燥成形且成小粒状，半稀便为糊状但不粘肛门，稀便为液体状且粘肛门。1.4.3血清抗氧化和肝功能指标采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定小鼠血清过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、总抗氧化能力（T-AOC）以及丙二醛（MDA）含量、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）活性。1.4.4血清炎症因子指标采用上海酶联生物科技有限公司生产的试剂盒测定小鼠血清白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量。1.4.5肠道形态观察将固定的结肠标本经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、摊片、常规苏木精-伊红(HE)染色处理，制成石蜡切片。在光学显微镜下使用明美数码分析系统（广州市明美光电技术有限公司）测量小鼠各肠段绒毛高度、隐窝深度，计算绒毛高度与隐窝深度的比值，并挑选典型视野拍摄成图片。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2019进行初步整理，SPSS 23.0统计软件的单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1牛乳外泌体对小鼠生长性能的影响（见表2）由表2可知，各组小鼠的末重和平均日增重差异不显著（P0.05）。与对照组相比，DSS组和Exo组小鼠的平均日采食量显著下降（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.018.T002表2牛乳外泌体对小鼠生长性能的影响组别初重/(g/只)末重/(g/只)平均日增重/[g/(只·d)]平均日采食量/[g/(只·d)]对照组12.36±1.0523.14±1.060.50±0.104.11±0.23aDSS组11.65±0.7922.89±1.740.50±0.213.46±0.48bExo组12.88±0.9822.60±0.700.44±0.073.61±0.38b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。g/只2.2牛乳外泌体对小鼠DAI评分的影响（见表3）由表3可知，适应期内3组小鼠的DAI评分均为0分。整个试验期内，对照组小鼠的DAI评分均为0分。试验第6、12 d，DSS组和Exo组小鼠的DAI评分均显著高于对照组（P0.05）；试验第12 d，Exo组小鼠的DAI评分显著低于DSS组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.018.T003表3牛乳外泌体对小鼠DAI评分的影响组别第1 d第6 d第12 d对照组00.00±0.00b0.00±0.00cDSS组02.79±0.11a3.51±0.12aExo组02.84±0.98a3.20±0.14b2.3牛乳外泌体对小鼠血清抗氧化指标和肝功能指标的影响（见表4、表5）由表4和表5可知，与对照组相比，DSS组和Exo组小鼠血清抗氧化和肝功能指标均差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.018.T004表4牛乳外泌体对小鼠血清抗氧化指标的影响组别CAT/(U/mL)T-AOC/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)T-SOD/(U/mL)MDA/(μmol/L)对照组30.77±26.243.94±0.69338.30±121.53179.14±57.1911.63±5.24DSS组28.44±4.673.50±0.50355.40±31.42184.83±48.3413.17±7.02Exo组23.65±10.223.01±0.69386.94±73.93220.24±13.7811.68±4.8410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.018.T005表5牛乳外泌体对小鼠血清肝功能指标的影响组别ALTAST对照组12.01±1.3817.25±4.45DSS组9.16±4.3612.59±3.68Exo组13.01±4.6313.72±3.35U/L2.4牛乳外泌体对小鼠血清炎症因子的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，DSS组和Exo组小鼠血清IL-6含量显著升高（P0.05）。各组小鼠血清IL-4、IL-10、TNF-α含量差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.018.T006表6牛乳外泌体对小鼠血清炎症因子的影响组别IL-4IL-10IL-6TNF-α对照组32.04±9.09145.35±36.254.10±3.03b398.57±16.40DSS组37.42±14.72158.21±19.9268.47±7.85a365.32±37.35Exo组28.60±12.74146.29±23.9959.77±7.60a379.28±17.50ng/L2.5牛乳外泌体对小鼠结肠与盲肠长度的影响（见表7）由表7可知，各组小鼠盲肠长度与结肠长度均差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.018.T007表7牛乳外泌体对小鼠肠道长度的影响组别盲肠结肠对照组2.74±0.159.23±0.84DSS组2.64±0.168.29±1.60Exo组2.57±0.269.06±0.77cm2.6牛乳外泌体对小鼠肠道形态的影响（见表8、图1）由表8可知，各组小鼠结肠绒毛高度、隐窝深度和绒毛/隐窝比值差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.018.T008表8牛乳外泌体对小鼠肠道形态结构的影响组别绒毛高度/μm隐窝深度/μm绒毛高度/隐窝深度对照组635.04±150.40133.95±44.005.20±2.17DSS组704.33±233.71129.13±40.306.12±3.13Exo组803.37±189.29132.31±56.706.98±3.10由图1可知，对照组小鼠各层结肠组织均清晰可见、黏膜上皮完整且连续，未发生炎症细胞浸润与溃疡。DSS组与Exo组小鼠结肠组织可见黏膜发生脱落，结肠绒毛中存在较多空腔，肠上皮吸收细胞和杯状细胞均少于对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.018.F001图1小鼠结肠黏膜组织形态（100×）3讨论3.1牛乳外泌体对结肠炎小鼠生长性能的影响有研究表明，饮用葡聚糖硫酸钠（DSS）可以降低小鼠体重和采食量，减短结肠长度，从而提高DAI评分，构建小鼠UC模型[14]。采用不同给药方式和不同剂量的DSS也会对造模产生不同的效果[15]。本试验中，与对照组相比，DSS组小鼠平均日采食量明显降低，与夏圣坤等[16]研究芹菜苷对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎的缓解作用中的模型组与空白组对比的结果相似，而灌喂牛乳外泌体后未能明显改善这一结果可能与灌服牛乳外泌体的剂量有关。3.2牛乳外泌体对结肠炎小鼠DAI评分、结肠长度和肠道形态的影响DAI评分是评价小鼠UC模型的重要指标。本试验结果显示，饮用DSS能够显著提高小鼠DAI评分，灌喂牛乳外泌体后又显著降低了DAI评分，表明DSS能够诱导小鼠溃疡性结肠炎发生，灌喂牛乳外泌体可能对小鼠腹泻、血便等症状有所改善，朱超慧等[17]也得出相似结论。贺庆芝等[18]研究发现，结肠炎小鼠结肠变短的原因可能与结肠发生充血并出现病变有关。芮雪琳等[19]和董晶等[20]研究发现，DSS模型组小鼠的结肠长度明显短于对照组。Benmoussa等[21]研究发现，牛乳细胞外囊泡可以防止DSS结肠炎小鼠结肠长度缩短，在调节炎症和免疫细胞浸润、阻止结肠降解以及恢复结肠炎后正常的黏蛋白分泌中起到一定作用，饲喂牛乳细胞外囊泡的小鼠结肠被认定为“更硬”和“更致密”。本试验中，各组小鼠的结肠长度均无显著差异。肠道绒毛高度和隐窝深度是衡量肠道的消化吸收能力的重要指标[22]，绒毛高度影响消化酶分泌，隐窝深度影响肠上皮细胞有丝分裂[23]。刘日亮等[24]研究表明，对照组小鼠结肠绒毛高度显著高于DSS模型组，DSS模型组小鼠结肠隐窝深度显著高于其他组，对照组小鼠的结肠绒隐比显著高于其他组。Li等[11]研究发现，牛乳外泌体能够增加坏死性小肠结肠炎（NEC）引起的杯状细胞减少，预防试验性坏死性小肠结肠炎的发展。Tong等[25]研究发现，口服牛乳外泌体能够显著提高结肠绒毛高度和隐窝深度，分析其原因可能与牛乳外泌体促进上皮吸收细胞增加有关。本试验中，各组小鼠的绒毛高度、隐窝深度和绒隐比差异均不显著，但DSS组与Exo组小鼠结肠上皮吸收细胞和杯状细胞数量均比对照组少，并存在较多空腔，表明DSS能够诱导小鼠结肠发生病变，灌喂10 μL牛乳外泌体具有一定改善作用。3.3牛乳外泌体对结肠炎小鼠血清抗氧化和肝功能指标的影响机体内自由基产生过多会使细胞产生氧化损伤[26]。T-AOC可直接反映机体抗氧化能力，CAT、T-SOD和GSH-Px等共同参与细胞内的抗氧化反应。MDA可以间接反映细胞氧化损伤程度，是膜脂发生过氧化反应时的最终分解产物之一[27]。ALT和AST可能会在心脏或肝脏出现异常时进入血液，使其在血清中的含量增多[28]。姚丽文等[29]研究厚壳贻贝多糖对结肠炎小鼠的改善作用，结果显示，DSS能够显著降低小鼠血清GSH-Px活性，试验组小鼠血清GSH-Px活性显著高于DSS组。游宇等[30]研究N-乙酰半胱氨酸对溃疡性结肠炎小鼠的作用，结果显示，模型组和盐水组小鼠血清SOD活性明显降低，而MDA含量明显升高。本试验中，与对照组相比，DSS组和Exo组小鼠血清生化指标和肝功能指标差异均不显著。3.4牛乳外泌体对结肠炎小鼠血清炎症因子指标的影响炎性因子失衡关系到溃疡性结肠炎的发生[31]，其中TNF-α和IL-6能够增强粒细胞向肠黏膜的迁移，从而诱导炎症反应，导致疾病发生[32-33]。IL-10具有抗炎和抗过敏作用，能够抑制促炎细胞因子的释放和抗原递呈[34]。IL-4主要是由CD4+T细胞极化的Th2细胞亚群分泌的炎性细胞因子[35]，能够在一定程度上减轻上皮细胞炎症[36]。李开秀等[37]分析间充质干细胞来源的外泌体可能是通过抑制TNF-α和IL-6等促炎因子和促进IL-10等抗炎因子的分泌，进而达到治疗炎症性肠病的效果。刘继攀等[38]发现，与对照组相比，模型组小鼠血清TNF-α和IL-6含量明显升高；与模型组相比，外泌体组小鼠血清TNF-α和IL-6含量明显降低，表明间充质干细胞外泌体能够显著缓解小鼠溃疡性结肠炎。王静燕[39]研究人脐带间充质干细胞来源的外泌体缓解小鼠结肠炎作用，结果显示，与对照组相比，模型组小鼠血清TNF-α和IL-6含量升高，IL-10含量明显降低，表明外泌体能够降低小鼠血清TNF-α和IL-6含量，升高IL-10含量。本试验中，DSS组和Exo组小鼠血清中促炎因子IL-6的含量均比对照组高，表明DSS能够促进炎症发生；但与DSS组相比，Exo组小鼠血清IL-6含量没有显著降低，可能与灌服外泌体的剂量有关。4结论本研究结果表明，灌喂10 μL牛乳外泌体（1 g/L）对DSS诱导结肠炎的小鼠影响有限，可能是由于所用剂量比较低所致。