抗生素在畜牧生产中的大范围超量使用易产生药物残留和耐药菌株等问题。我国饲料生产企业据农业农村部公告规定，2020年7月1日起将停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料。因此，寻找一种保持原有促生长作用且安全性高、副作用小的抗生素替代品成为畜牧生产中研究的方向与热点。益生菌制剂因其具有绿色无残留、毒副作用小等优点，作为抗生素的替代品在畜牧生产中大范围应用。益生菌能够抑制动物体肠道中一些病原性微生物的增殖[1]、改善反刍动物瘤胃发酵环境[2]、提高营养物质消化率、具有显著的促生长作用[3]，能够提高动物生长速度、生产性能和饲料利用率等，也会在一定程度上影响动物的生化指标[4-6]。研究发现，在仔猪日粮中添加植物乳酸菌和枯草芽孢杆菌，在肉鸡饲粮中添加地衣芽孢杆菌均会提高TP、ALB含量，降低BUN含量[7-8]。在中国荷斯坦犊牛日粮中添加纳豆芽孢杆菌可显著提高血清中IgG含量，降低IL-6含量[9]。用一定比例的微生物发酵饲料替代基础精料饲喂肉牛会提高肉牛血清中TP、ALB、IgA、IgG和IgM含量[10]。据报道，多种益生菌复合添加比单菌种益生菌饲喂效果更好，不同的益生菌组合添加效果也存在差异[11]。但目前关于复合益生菌对种公牛血清生长激素指标和免疫指标的研究还较少。本研究以纯种和牛种公牛为研究对象，探究日粮中添加复合益生菌对纯种和牛种公牛血清中生化指标、生长类激素指标和免疫指标的影响，为复合益生菌在种公牛生产中的应用提供数据支持和参考。1材料与方法1.1试验动物、日粮及饲养管理选取30头4岁、体重相近的纯种和牛种公牛，随机分为3组，每组10头牛。采用试验前后自身配对设计，以不同喂量饲喂复合益生菌，预试期10 d，正式试验期60 d，共70 d。试验前每组饲喂基础日粮，试验期3组在基础日粮中分别添加50、80、100 g/(头·d)的复合菌制剂。复合益生菌由黑龙江领康生物科技有限公司提供，有效成分为枯草芽孢杆菌≥1×109 CFU/g、酿酒酵母≥1×108 CFU/g。每日每头牛饲喂5 kg精料、3 kg燕麦，6 kg羊草。精料组成及营养水平见表1。其中，预混料购自科菲特饲料（齐齐哈尔）有限公司。试验动物单栏饲喂、自由饮水。精料、粗料分开饲喂，日喂2次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.002.T001表1精料组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米55.37综合净能/(MJ/kg)6.24豆饼22.13粗蛋白/%18.80麸皮8.17中性洗涤纤维/%16.02大麦11.33酸性洗涤纤维/%6.25石粉0.80钙/%0.55磷酸氢钙0.60磷/%0.32食盐0.60预混料1.001.2样品采集与测定两次采血，分别于饲养试验前1 d和试验结束第2 d 7：00，每组10头和牛静脉采血10 mL，置于促凝真空管，静置1 h后，3 000 r/min离心15 min，取上层血清，置于－80 ℃液氮中保存待测。1.2.1血清生化指标葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、白球比（A/G）采用比色法测定。1.2.2血清生长类激素指标生长激素（GH）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、四碘甲状腺原氨酸（T4），采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定。1.2.3血清免疫指标免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）采用比色法测定，白细胞介素－2（IL-2）、白细胞介素－6（IL-6）采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定。上述指标均由北京华英生物技术研究所测定。1.3数据统计与分析试验数据采用Excel 2010软件进行整理，结果采用SPSS 19.0软件进行配对样本T检验，试验数据以平均值和SEM表示，P＜0.05表示差异显著。2结果与分析2.1复合益生菌对和牛种公牛血清生化指标的影响（见表2）由表2可知，日粮中添加不同水平复合益生菌后，种公牛血清中GLU和TP含量均下降，A/G上升。其中，100 g/(头·d)组添加后GLU含量显著低于添加前（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.002.T002表2复合益生菌对和牛种公牛血清生化指标的影响项目添加量/[g/(头·d)]添加前添加后SEMP值GLU/(mmol/L)504.4873.1160.4800.104804.5703.0860.3540.0521004.633a3.390b0.2420.036BUN/(mmol/L)502.0881.8590.0850.113800.9521.3810.2520.2311001.9781.7720.6130.769TP/(g/L)5069.63260.1704.2840.1588064.38260.8524.5390.51810075.19270.0532.3120.156ALB/(g/L)5031.54928.8222.2270.3458029.71729.2291.1250.70710031.22231.4971.4740.869GLB/(g/L)5038.08331.3472.4520.1118034.66531.6233.6140.48910043.97038.5561.4910.068A/G500.8330.9200.0540.249800.8710.9460.0760.4301000.7340.8540.0440.112注：同行数据肩标大写字母不同差异极显著（P0.01），小写字母不同差异显著(P0.05),小写字母相同或无字母肩标差异不显著（P0.05）；下表同。2.2复合益生菌对和牛种公牛血清生长类激素指标的影响（见表3）由表3可知，添加不同水平复合益生菌后，GH含量增加但差异不显著（P0.05），50 g/(头·d)和80 g/(头·d)组复合益生菌组添加后，T3含量分别显著（P0.05）、极显著（P0.01）低于添加前。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.002.T003表3复合益生菌对和牛种公牛血清生长类激素指标的影响项目添加量/[g/(头·d)]添加前添加后SEMP值GH502.5747.3521.1410.053806.8058.1441.4120.4431004.4575.2662.3860.767T3507.352a0.923b1.0550.026808.144A0.930B0.1450.0001005.2661.0301.6770.127T45075.74574.9587.7460.9288068.97173.4699.0920.67010091.95868.3546.0540.060μg/L2.3复合益生菌对和牛种公牛血清免疫指标的影响（见表4）由表4可知，添加不同水平复合益生菌后，IgG、IgM和IL-6含量均下降，但差异不显著（P0.05）。其中，50 g/d组复合益生菌添加后，IgA和IL-2含量均显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.002.T004表4复合益生菌对和牛种公牛血清免疫指标的影响项目添加量/[g/(头·d)]添加前添加后SEMP值IgA/(g/L)500.769a0.736b0.0040.012800.6910.7550.0470.3071000.8510.8720.1420.897IgG/(g/L)5010.5709.7881.2690.6018011.10810.2231.3860.58910010.75210.7331.1760.989IgM/(g/L)503.1372.2490.3490.126802.6332.4780.3930.7321002.6732.4660.4850.711IL-2/(ng/L)50317.949a186.836b14.2910.01280195.225212.54318.3960.446100269.753225.91146.4890.445IL-6/(ng/L)50194.180125.98130.0280.15180157.247118.13110.7140.068100199.794120.40431.2660.1263讨论3.1复合益生菌对和牛种公牛血清生化指标的影响动物自身对血液中各项生化指标具有一定的自我调节能力，因此血清中多数生化指标会在一定范围内波动，除非某些特殊生理状态下才会发生显著性变化。试验中添加复合益生菌前后各试验组种公牛绝大部分血清生化指标间没有显著性差异，只有100 g/(头·d)组添加后血清GLU含量显著低于添加前（P0.05），即试验所添加的复合益生菌不改变种公牛绝大多数正常的血清生化指标，可能与复合益生菌饲喂时间有限及种公牛自身体况有关。在单胃动物方面，有研究表明，在仔猪日粮中添加植物乳酸菌和枯草芽孢杆菌会提高TP、ALB含量，降低BUN含量[7]；在断奶仔猪日粮中添加益生素会提高血糖，降低BUN含量[12]；在肉鸡饲粮中添加地衣芽孢杆菌均会提高TP、ALB含量，降低BUN含量[8]。而在反刍动物方面的研究结果却不完全一致，王玲等[13]研究表明，在奶牛饲粮中添加复合酵母培养物能显著提高血清GLU含量，并显著降低血清BUN含量；符运勤等[14]和闫晓刚[15]研究报道，犊牛饲粮中添加不同组合益生菌对犊牛血清生化指标无显著影响；Peng等[16]发现，纳豆芽孢杆菌对奶牛血清生化指标也无显著影响。以上研究表明，饲粮中添加益生菌对血清生化指标的影响可能与益生菌组成、用量、饲喂时间、动物种类及所处生长阶段等多种因素有关。BUN是蛋白质在动物体内进行代谢的终末产物，通常来说BUN含量增加说明动物体内蛋白分解加强，用于沉积的蛋白质减少[17]，若BUN含量下降，则说明动物体内蛋白质合成加强，分解减少，机体对氮的利用率提高[18]。严念东等[19]研究发现，动物血浆BUN含量与体内氨基酸平衡密切相关，在正常范围内，BUN含量较低可平衡动物体内氨基酸组成。赵会利等[9]研究表明，FCGM中功能性成分纳豆芽孢杆菌可显著降低犊牛血清中BUN含量，说明饲喂FCGM日粮有利于犊牛体内蛋白代谢和氨基酸平衡。本试验中，添加复合益生菌前后种公牛血清BUN含量下降（P0.05），说明添加复合益生菌有可能使种公牛利用自身的机体蛋白较少，消化利用情况较好，种公牛合成蛋白质能力加强，提高机体对氮的利用率，由于本试验未对试验动物进行营养代谢消化试验，尚无法提供有力的证明。本试验添加复合益生菌前后种公牛血清BUN含量无显著性差异可能是日粮中复合益生菌添加量还未达到引起血清中BUN明显变化的剂量或给种公牛饲喂时间较短。血清TP能够从总体上反映动物体内蛋白质合成情况，可分为ALB和GLB[20]。当血清TP含量增加时，机体代谢水平提高，免疫力增强。血清ALB自身携带负离子，是体内营养物质运输的载体，同时在更新组织蛋白和维持血管内渗透压方面也具有重要作用；肝脏内合成的血清GLB，具有免疫作用，可直接作用于抗原，是机体免疫的分子基础[21]，也被称为免疫球蛋白，可在一定程度上反映机体免疫力强弱[22]。本试验中，添加复合益生菌前后种公牛血清中的TP、ALB、GLB含量均无明显变化，说明添加复合益生菌可使种公牛免疫机能维持在一定状态。3.2复合益生菌对和牛种公牛血清生长类激素指标的影响由甲状腺分泌的甲状腺激素对动物生长发育早期阶段尤为重要，可影响动物生长速度及体内物质代谢状况[23]。甲状腺素包括T3和T4两种，若T3、T4含量增加，则会加快动物基础代谢速度[24]。T3在生理活性上的远高于T4，是T4活性的5倍。T3主要作用是促进脂肪酸的氧化而抑制脂肪的沉积。因此，当血液中T3含量上升时，可抑制脂肪的沉积，可以加强血液激素对机体的促进脂肪分解、抑制脂肪沉积的能力[25]。本试验结果表明，80 g/(头·d)组添加后T3含量极显著低于添加前（P0.01），50 g/(头·d)组添加后T3含量显著低于添加前（P0.05）。100 g/(头·d)组添加后与添加前相比虽统计上未达到差异显著性水平，但数值上有所下降，说明不同水平的复合益生菌添加后可能使得脂肪沉积能力增强。而在T4含量上，因为T4生物活性较低，由此推测在脂肪代谢过程中不起主要作用。甲状腺素具有促进组织代谢、机体生长发育和能量代谢的作用，并且较高水平的甲状腺激素会降低机体内氮沉积[26]，因此推测T3含量下降会促进机体内氮沉积，这与本试验添加复合益生菌后血清BUN含量下降可能是由于提高种公牛蛋白质的沉积，提高对氮的利用率相互印证。GH可调控动物生长，在动物幼年阶段更为明显，可提高动物增长速度，促进蛋白质合成及脂肪分解，减少脂肪沉积[27]。本试验中，添加复合益生菌后血清GH含量增加（统计上差异不显著，数值上增加）可能是此时期种公牛蛋白质沉积较多，而脂肪沉积较少引起的。这一结果也与先前血清中BUN和T3含量下降的可能原因相一致。由于受生长激素释放因子和生长抑制激素双重控制，GH呈现脉冲式分泌的特点[28-29]。也有研究表明，某些动物GH分泌呈阵发性特点，不同时间点规律性较弱。本试验中，种公牛血清中GH含量在添加复合益生菌前后虽数值上有所增加但未达到差异显著性水平，可能与GH的脉冲式分泌以及动物神经系统在进行自身调节时的复杂性有关，相关原理有待于进一步研究。3.3复合益生菌对和牛种公牛血清免疫指标的影响IgA是黏膜免疫的主要抗体，具有在非特异性免疫防护机制的协助下减少抗原入侵的作用[30]，约占血清免疫球蛋白总量的10%~20％，其免疫作用相对较弱，可以与周围细胞组成局部免疫系统[31]。IgG是体液免疫反应中的主要抗体[30]，在人和动物体内含量最高，易穿过毛细血管壁，进而进入组织中与抗原进行反应，是机体进行免疫过程中的主要免疫球蛋白[32]。血清IgM含量提高提示动物机体近期发生感染[33]。本试验中，在种公牛日粮中添加复合益生菌后，血清IgM含量与添加前相比虽差异不显著但数值上均有下降趋势，提示添加复合益生菌后未使种公牛机体发生感染。有研究表明，用一定比例的微生物发酵饲料替代基础精料饲喂肉牛会提高肉牛血清中IgA、IgG和IgM含量，提高其机体免疫能力[10]。但乔国华等[34]研究发现，给后备牛饲喂由白腐真菌、啤酒酵母菌和耐盐短杆菌组成的发酵饲料，添加组与未添加组相比无明显变化。本研究中，添加复合益生菌后种公牛血清仅50 g/(头·d)组IgA含量显著降低，其余组及IgG和IgM含量添加前后均无显著性差异，与乔国华等[34]试验结果类似，这可能是发酵使用微生物不同、试验动物个体差异及生长阶段不同所致。白细胞介素（IL）是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。细胞因子在机体炎症反应中起重要作用[35]，能够体现细胞免疫功能强弱。细胞因子分为促炎性因子和抗炎性因子两类，促炎性因子常见的包括IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α等，抗炎性因子常见的包括IL-4和IL-10等[36-37]。当动物体内的促炎性因子大量并长期存在时可产生大量自由基，进而损伤机体细胞、组织及器官，使其发生病理性改变，引发炎症反应，导致各种营养素在各组织和器官间重新分配，使动物对各种营养素利用率下降[38]，最终对动物的生长发育和生产性能起负面作用。本试验中，除80 g/(头·d)组外，添加不同水平的复合益生菌后，IL-2和IL-6含量均有下降趋势，其中50 g/(头·d)组IL-2含量显著下降，其他组虽未达到差异显著性水平但有下降趋势，可能是添加剂量不够、添加时间较短而使效果不够明显或由于种公牛生理特点原因存在适应剂量等造成。试验表明，添加复合益生菌能够抑制促炎症因子的释放，减弱种公牛的炎症反应，减少对组织器官的伤害，进而提升种公牛的免疫机能，由此推测添加复合益生菌对种公牛机体未产生负面影响，不会损害细胞及组织，不会降低营养物质利用效率。4结论50 g/(头·d)和80 g/(头·d)复合益生菌组种公牛血清中T3含量显著提高；50 g/(头·d)组复合益生菌添加后，血清中IL-2含量显著降低；日粮中添加复合益生菌能够促进脂肪沉积，抑制血清中促炎症因子的释放，减弱种公牛的炎症反应，减少对组织器官的伤害，进而提升种公牛的免疫机能。