蛋鸡产蛋期分为产蛋前期、产蛋高峰期和产蛋后期，蛋鸡产蛋高峰期维持3~4个月后，进入产蛋后期[1]。在产蛋后期，蛋鸡的生理机能开始衰弱，器官逐渐衰老，肠道消化吸收以及免疫功能下降[2-4]，蛋鸡的产蛋率、蛋品质也随之下降，蛋鸡死淘率数量增加[5]。近年来，关于维生素、矿物质、益生菌以及中草药等成分在蛋鸡养殖中应用的研究较多[6-9]。二至丸是由女贞子、墨旱莲组成的经典中药方剂，具有补益肝肾、滋阴止血的功效[10]。现代药理研究结果显示，二至丸具有抗氧化、增强免疫、抗炎及调节免疫等功效[11-12]。目前，关于二至丸在动物方面的应用研究多集中于调节小鼠骨质疏松和内分泌等方面[13-15]，而在产蛋后期蛋鸡的应用研究尚未见报道。本研究主要探究二至丸对产蛋后期蛋鸡生产性能、肠道形态及免疫功能的影响，为开发提高产蛋后期蛋鸡生产性能和免疫功能的饲料添加剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验材料二至丸购自中贝佳美生物科技有限公司，由女贞子和墨旱莲按1∶1组成；益母增蛋散购自天津市诺维动物药业，由黄芪、熟地黄、当归、淫羊藿、女贞子等组成。1.1.2仪器设备罗氏比色扇（南京铭奥仪器设备有限公司），游标卡尺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），YT-12B生物组织智能脱水机，YB-2L石蜡包埋机，YK-8生物组织摊烤片机（湖北耀楚医疗器械科技有限公司），RM2235石蜡切片机（徕卡显微系统贸易有限公司），B203光学显微镜（郑州南北仪器设备有限公司），荧光定量PCR仪（美国伯乐公司），PCR扩增仪（德国耶拿分析仪器股份公司），高速冷冻离心机（贝克曼库尔特（美国）股份有限公司）。1.1.3试剂二甲苯、苏木素染液、伊红染液、无水乙醇、树胶等，均购自北京索莱宝科技有限公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒，均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。1.2试验设计及饲养管理试验于河北省邯郸市鑫冠禽业有限公司进行。选取180只60周龄京粉一号健康蛋鸡随机分为5组，每组3个重复，每个重复12只鸡。蛋鸡采用全自动3层笼养，常规饲养。对照组蛋鸡饲喂基础日粮，阳性对照组蛋鸡饲喂基础日粮添加0.5%益母增蛋散，3个试验组分别在基础日粮中添加0.5%、1.0%、1.5%二至丸。试验期42 d，每天记录饲喂情况和试验鸡状态。基础日粮为玉米-豆粕型饲粮，由邯郸市鑫冠禽业有限公司提供，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.011.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100玉米63代谢能/(MJ/kg)11.30豆粕22粗蛋白质/%15.90石粉8粗纤维/%2.31麦麸2钙/%3.65豆油1总磷/%0.50预混料4赖氨酸/%0.80蛋氨酸/%0.34注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 10 000 IU、VD3 1 500 IU、VE 25 IU、VK 31 mg、VB6 8 mg、VB12 0.03 mg、泛酸16 mg、叶酸1.5 mg、生物素0.5 mg、Fe 95 mg、Cu 8 mg、Zn 70 mg、Mn 80 mg。2.营养水平均为计算值。1.3测定指标及方法1.3.1生产性能试验期间，每天记录蛋鸡产蛋数、耗料量、蛋重，计算平均日采食量、平均蛋重和产蛋率。产蛋率=产蛋个数/存栏量×100%(1)平均蛋重=蛋总重/蛋个数(2)平均日采食量=(总投料重量-剩余料重)/试验天数(3)1.3.2蛋品质试验结束后每组选取10枚鸡蛋分别称重，使用游标卡尺测量蛋纵、横径长，计算蛋形指数。将蛋打破倒于已经调为水平位置的玻璃板上，使用高度游标卡尺测量与蛋黄距离1 cm处的蛋白作为蛋白高度测定点，根据蛋白高度和蛋重计算哈夫单位。使用游标卡尺和高度游标卡尺测量蛋黄高度和宽度，计算蛋黄指数。使用游标卡尺测量蛋壳尖端、钝端以及中间位置的蛋壳厚度，计算蛋壳厚度。使用罗氏比色扇在日光灯下测定蛋黄颜色。蛋形指数=蛋纵径长/蛋横径长(4)蛋黄指数=蛋黄高度/蛋黄直径(5)蛋壳厚度=(尖端蛋壳厚度+钝端蛋壳厚度+中间蛋壳厚度)/3(5)哈夫单位=100×lg(浓蛋白高度+7.57-1.7×蛋重0.37)(6)1.3.3肠道组织形态试验结束时，每个重复选2只鸡解剖，取蛋鸡十二指肠、空肠以及回肠各两份。一份使用0.9%生理盐水冲洗肠道内容物，放入4%甲醛固定液中做好标记，进行固定；另一份使用锡纸袋分装，做好标记放入液氮中，转至-80 ℃冰箱保存。将固定液中的肠组织取出切成0.5 cm的肠段，采用石蜡切片HE染色法：乙醇脱水-组织透明-石蜡包埋-连续切片-贴片烤片-HE染色。每个样本观察3个不连续的切片，每张切片最少选2个不同视野。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度、隐窝深度，计算绒隐比。1.3.4肠道免疫因子相关基因表达量液氮冷冻研磨提取十二指肠、空肠和回肠肠组织中总RNA，按照逆转录试剂盒说明进行反转录。采用荧光定量PCR方法检测白细胞介素-4（IL-4）、转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因mRNA表达量。反应体系：SYBR 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 1.5 μL、ddH2O 7.7 μL、总体积为20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。目标基因和内参基因β-肌动蛋白（β-actin）的引物序列见表2。采用相对定量分析法，使用2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。引物由上海生物工程公司进行合成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.011.T002表2目标基因和内参基因β-肌动蛋白（β-actin）的引物序列引物名称基因库编号引物序列（5'→3'）扩增产物大小/bpIL-4NM 001007079.1F：GTTCTCCTCTCACACAGCCAAGCR：ATGGTGCCTGCAACGGAAGATG88TGF-βNM 205454.1F：AGCCACTGACGATCTTGTACTATGTTGR：CACTTGCAGGATTTCACCACCATATTG82IL-2NM 204153.1F：TACCTGGGAGAAGTGGTTACTCTGAAGR：CGGTGTGATTTAGACCCGTAAGACTC127TNF-αNM 204267.1F：CTCAGGACAGCCTATGCCAACAAGR：GGCGGTCATAGAACAGCACTACG86β-actinNM-205518.1F：GAGAAATTGTGCGTGACATCAR：CCTGAACCTCTCATTGCCA1521.4数据统计与分析数据采用Excel 2019初步整理，SPSS 20.0进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1二至丸对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响（见表3）由表3可知，0.5%、1.0%、1.5%二至丸组蛋鸡的产蛋率分别比对照组提高了26.83%、25.20%、17.88%（P0.05），阳性对照组蛋鸡的产蛋率比对照组提高了23.88%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.011.T003表3二至丸对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响组别产蛋率/%平均蛋重/(g/枚)平均日采食量/[g/(只·d)]对照组54.91±7.82b51.99±1.4292.35±5.54b0.5%二至丸组69.64±8.79a57.38±5.17101.89±6.31a1.0%二至丸组68.75±8.13a53.96±3.56101.87±8.61a1.5%二至丸组64.73±7.60a54.09±1.9699.30±10.82a阳性对照组68.02±9.37a55.45±2.51101.64±6.52a注：同列数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。0.5%、1.0%、1.5%二至丸组蛋鸡的平均日采食量分别比对照组提高了10.33%、10.31%、7.53%（P0.05），阳性对照组蛋鸡的平均日采食量比对照组提高了10.06%（P0.05）。2.2二至丸对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，0.5%二至丸组鸡蛋的蛋黄指数显著下降（P0.05）；0.5%、1.0%二至丸组鸡蛋的蛋黄颜色显著升高（P0.05）；3个试验组和阳性对照组鸡蛋的哈夫单位均显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.011.T004表4二至丸对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响组别蛋形指数蛋黄指数蛋黄颜色哈夫单位蛋壳厚度/mm对照组1.27±0.030.50±0.01a11.67±0.33b72.05±2.88d0.49±0.060.5%二至丸组1.30±0.030.46±0.00b15.00±0.00a80.48±1.01c0.52±0.041.0%二至丸组1.29±0.030.50±0.01a15.33±0.33a87.19±1.71b0.58±0.111.5%二至丸组1.28±0.030.53±0.01a13.67±1.45ab91.65±0.72ab0.70±0.16阳性对照组1.24±0.040.53±0.01a14.00±0.00a95.38±0.50a0.54±0.062.3二至丸对产蛋后期蛋鸡肠道形态的影响（见图1、表5）由图1、表5可知，与对照组和阳性对照组相比，0.5%二至丸组蛋鸡十二指肠绒毛高度显著增加（P0.05）；3个试验组蛋鸡的十二指肠隐窝深度显著降低（P0.05）；0.5%、1.5%二至丸组蛋鸡十二指肠绒隐比均显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.011.F001图1二至丸对产蛋后期蛋鸡肠道形态镜检结果注：1.A为对照组，B为0.5%二至丸组，C为1%二至丸组，D为1.5%二至丸组，E为阳性对照组。2.蓝色箭头为肠绒毛断裂，黑色箭头为肠绒毛上皮细胞脱落、自溶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.011.T005表5二至丸对产蛋后期蛋鸡肠道形态的影响组别十二指肠空肠回肠绒毛高度/μm隐窝深度/μm绒毛高度/隐窝深度绒毛高度/μm隐窝深度/μm绒毛高度/隐窝深度绒毛高度/μm隐窝深度/μm绒毛高度/隐窝深度对照组947.20±102.10b160.20±14.08a6.10±0.77b792.60±50.01bc103.80±9.93b7.26±0.94b614.20±46.23ab91.50±12.02ab6.73±1.070.5%二至丸组1 192.00±135.30a128.30±21.81b8.09±1.48a892.90±84.73a131.90±18.12a7.18±0.72b692.20±259.30a102.30±13.16a6.16±0.801.0%二至丸组1 046.00±147.80ab119.20±16.93b7.63±2.20ab865.90±130.70ab85.32±15.46c10.39±1.36a644.30±116.40a88.20±16.35b6.76±1.111.5%二至丸组1 117.00±84.33ab119.10±18.76b8.64±0.65a865.70±55.00a117.90±17.66b7.19±1.26b590.90±93.20ab96.18±10.99ab6.92±1.37阳性对照组961.60±206.00b156.90±11.50a5.99±1.57b887.80±61.25a131.40±16.44a6.56±0.68b509.40±30.07b92.84±17.29ab5.83±1.49与对照组相比，0.5%、1.5%二至丸组和阳性对照组蛋鸡空肠绒毛高度均显著升高（P0.05）。与对照组和阳性对照组相比，1.0%二至丸组蛋鸡空肠隐窝深度显著降低（P0.05）；1.0%二至丸组蛋鸡空肠绒隐比显著升高（P0.05）。与阳性对照组相比，0.5%、1.0%二至丸组回肠绒毛高度显著升高（P0.05）。2.4二至丸对产蛋后期蛋鸡肠道炎性因子的影响（见表6）由表6可知，与对照组和阳性对照组相比，1.5%二至丸组蛋鸡十二指肠IL-2、IL-4的mRNA相对表达量显著升高（P0.05）。与对照组相比，1.5%二至丸组蛋鸡十二指肠TNF-α的mRNA相对表达量显著降低（P0.05）。与对照组和阳性对照组相比，1.5%二至丸组蛋鸡十二指肠TGF-β的mRNA相对表达量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.011.T006表6二至丸对产蛋后期蛋鸡肠道炎性因子的影响组别十二指肠空肠回肠IL-2IL-4TNF-αTGF-βIL-2IL-4TNF-αTGF-βIL-2IL-4TNF-αTGF-β对照组1.04±0.10bc1.02±0.15b0.96±0.22a1.03±0.18b0.98±0.05c1.02±0.23b1.00±0.09a0.97±0.09b1.04±0.09c1.01±0.05bc1.01±0.13a1.09±0.17b0.5%二至丸组0.90±0.16c0.91±0.16b0.92±0.10a1.13±0.11b1.54±0.19ab0.97±0.26b0.59±0.13b0.94±0.12b1.69±0.26b0.76±0.23c0.89±0.15a1.14±0.26b1.0%二至丸组1.34±0.08b1.16±0.19ab0.82±0.11ab1.15±0.16b1.18±0.25bc1.32±0.25a0.75±0.13b0.64±0.19c1.87±0.22b1.25±0.60b0.88±0.12ab1.44±0.21a1.5%二至丸组1.69±0.21a1.32±0.30a0.72±0.13b1.64±0.12a1.78±0.30a1.16±0.27ab0.71±0.12b0.73±0.11c1.84±0.26b1.31±0.32b0.85±0.19ab0.85±0.19c阳性对照组1.20±0.29bc1.05±0.16b0.81±0.11ab1.17±0.12b1.50±0.48ab1.20±0.21ab0.68±0.16b1.32±0.25a3.38±0.55a2.40±0.20a0.68±0.10b0.97±0.14bc与对照组相比，0.5%、1.5%二至丸组蛋鸡空肠IL-2的mRNA相对表达量显著升高（P0.05），1%二至丸组蛋鸡空肠IL-4的mRNA相对表达量显著升高（P0.05）。所有试验组蛋鸡空肠TNF-α的mRNA相对表达量均显著低于对照组（P0.05）。与对照组和阳性对照组相比，1.0%和1.5%二至丸组蛋鸡空肠TGF-β的mRNA相对表达量显著下降（P0.05）。与对照组相比，3个试验组蛋鸡回肠IL-2的mRNA相对表达量均显著升高（P0.05）；1.0%和1.5%二至丸组蛋鸡回肠IL-4的mRNA相对表达量均显著升高（P0.05）；1.0%二至丸组TGF-β的mRNA相对表达量显著上升（P0.05），1.5%二至丸组TGF-β的mRNA相对表达量显著下降（P0.05），与阳性对照组相比，1.0%二至丸组回肠TGF-β的mRNA相对表达量显著升高（P0.05）。3讨论3.1二至丸对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响生产性能是评价蛋鸡养殖经济效益的一个重要指标，产蛋后期蛋鸡产蛋率降低，并常常伴随着蛋品质下降的现象。女贞子为二至丸的主要成分之一，女贞子富含多种生物活性物质，具有增强机体免疫功能、改善畜禽生产性能的优点[16]。张耀文等[17]研究表明，在日粮中添加女贞子粉能够提高70周龄海兰褐蛋鸡产蛋率和蛋品质，增加蛋鸡的平均日采食量。闫先锋等[18]研究表明，女贞子可提高20周龄海兰褐蛋鸡蛋品质，提高饲料转化率。陈杨超等[19]选用6味中药分别添加在产蛋后期蛋鸡日粮中，发现女贞子组可显著提高蛋鸡的产蛋率，从而提高蛋鸡的生产性能。墨旱莲是菊科植物鳢肠（Eclipta prostrata L.）的地上部分，具有滋补肝肾、止血凉血的功效[20]。给更年期模型大鼠饲喂墨旱莲、丹参、覆盆子口服液，能够提高大鼠血清中雌二醇的含量，显著提高大鼠子宫脏器系数[21]。刘幸等[22]使用墨旱莲喂养高脂小鼠，发现不同剂量墨旱莲组高脂小鼠的体重得到不同程度的改善，并具有降脂作用。Iqbal等[23]研究胡萝卜和墨旱莲对顺铂所致大鼠肾毒性的保护作用，结果发现，墨旱莲可以改善顺铂所导致大鼠体重下降的问题，并且高剂量组的效果优于低剂量组。在乙基亚硝基脲诱导的白血病小鼠体重明显下降情况下，使用墨旱莲进行治疗的小鼠体重和身体状况出现好转并增加存活率[24]。本试验发现，二至丸组分别提高蛋鸡的产蛋率，增加了平均蛋重，提高了蛋鸡的平均日采食量，与上述研究结果相似。可能是因为在日粮中添加二至丸增加了蛋鸡饲粮的适口性，从而提高了蛋鸡的平均采食量。二至丸中有效成分可改善了蛋鸡肠道消化吸收功能，提高了饲料转化率，从而提高产蛋率。3.2二至丸对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响蛋品质能够决定鸡蛋的价值，蛋黄颜色、哈夫单位能够反映鸡蛋的内在品质，蛋重、蛋壳厚度等能够反映鸡蛋的外在品质。人们在购买鸡蛋时，会着重选择蛋壳光滑、蛋黄颜色深、单个蛋重高的产品。随着蛋鸡年龄的增长，哈夫单位将会逐渐降低，而哈夫单位越高，表明鸡蛋新鲜蛋白质量高[25-26]。Li等[27]在日粮中添加女贞子发现，女贞子可以提高鸡蛋的哈夫单位，增加鸡蛋的新鲜度。陈杨超等[19]发现，女贞子可以显著增加蛋黄的相对重量，显著提高蛋黄颜色，表明女贞子可以改善鸡蛋品质。研究发现，在日粮中添加枸杞、益母草、五味子以及女贞子等中草药提取物或者活性成分均可提高蛋鸡的生产性能以及蛋品质[28-32]。本试验中，添加二至丸可显著提高鸡蛋的蛋黄指数以及哈夫单位，提高鸡蛋的内在品质，增加蛋壳厚度，提高蛋壳质量，与上述试验结果一致。3.3二至丸对产蛋后期蛋鸡肠道形态的影响肠道是营养物质消化吸收的主要场所，肠道吸收速率是影响家禽生长及生产性能的主要因素[33]。而绒毛高度、隐窝深度和绒隐比是评估肠道消化吸收的重要指标[17]，其与肠道消化吸收能力成正比。当肠绒毛高度增加时，会促进食糜与肠绒毛的充分接触，增加接触面积[34-35]，酶的分泌也会增加，促进营养物质的消化吸收。因此在评估产蛋后期蛋鸡生产性能时，蛋鸡肠道消化吸收能力也是一个重要指标[36-37]。绒毛高度能够反映肠上皮细胞成熟率，肠道隐窝中细胞具有向绒毛顶端迁移的能力，隐窝深度变浅则会加快细胞分化的速度，从而使得肠绒毛不断生长，肠道细胞不断更新[4,38]。绒隐比越高，表明小肠消化吸收功能增强，绒隐比减小表明肠黏膜受损[17]。张迪[39]研究表明，在断奶仔猪日粮中添加不同剂量女贞子可以不同程度地提高仔猪十二指肠和回肠绒毛长度和空肠和回肠绒隐比，保持了肠道形态结构的完整性。本试验中，日粮中添加不同剂量的二至丸均不同程度地提高了蛋鸡肠绒毛高度以及绒隐比，这有助于保持健康的肠道环境和肠道完整性，从而吸收更多的营养成分，提高蛋鸡的生产性能。3.4二至丸对产蛋后期蛋鸡肠道炎性因子表达量的影响肠道是消化吸收的主要场所，更是保护机体不受致病菌侵害的重要防线，对维持营养代谢和免疫功能发挥重要作用[40-41]。肠道屏障包括物理、化学、微生物及免疫屏障，这些屏障相互作用与肠道结构完整、免疫系统和微生物菌群等相关[42]。物理屏障由肠道黏膜层上皮细胞组成，肠内壁的肠绒毛越高隐窝深度越低表明肠道上皮细胞分化率增加，促进肠绒毛内杯状细胞及肠细胞的分化，从而增强免疫功能[43]。而黏膜层分泌的黏蛋白、免疫球蛋白以及细胞因子等物质是影响肠道免疫功能作用的原因之一，当肠道免疫功能强大时，又会增加黏膜层的稳定性[44]。于杜娟[45]研究表明，在产蛋高峰后期蛋鸡日粮中添加女贞子提取物可显著提高蛋鸡体内白细胞介素-2（IL-2）和免疫球蛋白含量，提高蛋鸡机体的免疫功能。乔国华等[46]在羔羊代乳粉中添加女贞子粉，发现在羔羊17、24、31日龄血液中IL-1β、IL-6和IL-8含量均低于对照组，调节了羔羊血液中炎性因子的表达。李文[47]研究表明，墨旱莲EAP20-2能够下调LPS导致的肺组织IL-1β的高表达，减少促炎因子产生，减轻炎症反应。Law等[24]在乙基亚硝基脲诱导小鼠模型中NF-κB通路被激活，促炎因子IL-1β表达上调，而用墨旱莲治疗后IL-1β显著减少，起到抗炎作用。机体中Ⅰ型免疫细胞和Ⅱ型免疫细胞所分泌的细胞因子均会促进自身繁殖并且抑制对方增殖，因此在机体中Ⅰ型免疫细胞和Ⅱ型免疫细胞会处于相对平衡的状态。本试验中，蛋鸡肠道组织中IL-2 mRNA表达增加，可能是因为在日粮中添加二至丸激活了蛋鸡先天免疫系统中细胞因子及其反应机制，对免疫应答产生了调节作用。IL-2和TNF-α是由Ⅰ型免疫细胞因子分泌，参与细胞免疫。IL-4是典型的Ⅱ型免疫细胞因子，作用于B细胞表面的细胞因子受体，促进B细胞大量增殖，并且进一步分化和产生抗体[48]，而且IL-4能够促进肠道杯状细胞增殖并产生更多可溶性黏蛋白，对肠道起保护作用。TGF-β是一种保持免疫系统平衡并协调组织器官损伤后修复的体内平衡因子，TGF-β能够直接诱导或者通过调控其他信号进行免疫调节作用[49】。而抗炎因子IL-4、TGF-β mRNA高表达与促炎因子TNF-α低表达相对立，这可能与二至丸对免疫应答具有调节作用有关，抑制促炎因子表达，刺激抗炎因子表达，减轻炎症刺激。有研究表明，TNF-α和IFN-γ等促炎因子可激活NF-κB信号通路，使肠道紧密连接紊乱损害上皮屏障功能[50]。在本试验中，日粮中添加不同剂量的二至丸会不同程度地提高蛋鸡肠道抗炎能力，增强免疫力，调节免疫因子的表达，有利于提高机体整体免疫能力。4结论在本试验条件下，日粮中添加二至丸可显著提高产蛋后期蛋鸡产蛋率和平均日采食量，改善蛋品质、肠道形态结构，提高肠道免疫功能，添加0.5%二至丸效果较好。