吲哚是一种在自然界广泛存在的天然化合物[1]，吲哚及其衍生物在生物医药、农业等领域广泛应用[2]。吲哚及其衍生物能够调节植物生长[3]，可作为食品添加剂的有效成分[4]。研究发现，植物和微生物本身能够合成吲哚，但犬、猪和牛等动物体内主要由肠道微生物合成吲哚[5]。体内高浓度吲哚易引起糖尿病和血红蛋白尿症等疾病；但体内低浓度吲哚具有多种生物活性[6]，如吲哚能够调节人肠道上皮细胞功能、炎症因子[7]和肠胰岛素分泌[8]。吲哚是动物体内色氨酸的代谢产物，但动物生产中主要通过调节色氨酸摄入水平促进动物生产。色氨酸能够影响家禽采食量和日增重[9-11]；改善猪的小肠绒毛高度、肉质、泌乳母猪产乳量[12-14]；提高奶牛产奶量[15]；提高绵羊血液褪黑素含量[16]。关于添加吲哚对动物生产性能影响的相关研究较少。吲哚主要分布在动物肠道，吲哚的生产菌（大肠杆菌和弧菌等）在色氨酸合成酶的作用下转化分支酸，从而催化中间产物生成吲哚，或生产菌在色氨酸酶的作用下转化色氨酸生成吲哚。肠道菌群失调是影响动物肠黏膜屏障功能的主要因素之一。研究发现，吲哚能够影响动物肠道细菌质粒稳定性[17]、抗生素抗性[18]、生物膜形成及菌群群体感应[19]。吲哚主要经动物小肠吸收后在肝脏代谢为吲哚酚硫酸，从而影响动物生理功能。吲哚能够竞争性结合芳烃受体[20]，维持动物肠道有益菌群体稳定[21]，而芳烃受体的减少能够增加机体对病原菌感染的免疫应答[22]。因此，吲哚可作为信号分子调节动物肠道菌群间的相互作用，影响菌群生理及肠黏膜屏障[23]。但目前关于吲哚对水禽肠道形态和肠道菌群影响的研究较少。高邮鸭为肉蛋兼用良种，探索应用生物活性物质改善鸭肠道健康对养鸭业的健康发展具有重要意义。本研究在高邮鸭饲粮中添加吲哚，分析吲哚对高邮鸭生长性能、血清生化指标、肠道形态、盲肠菌群数量的影响，以期为吲哚在促进鸭肠道健康中的有效应用提供参考。1材料与方法1.1主要仪器与试剂PCR仪（S1000，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）、荧光定量PCR仪（MA-6000，苏州雅睿生物技术有限公司）、全自动生物组织脱水机（ASP300S，Leica）、冷热台包埋机（EC350-1，Microm）、AUTOSTAINER XL全自动染色机（ST5010，Leica）、显微成像系统（DP72，Olympus）。AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix试剂盒（Q141-02，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）、吲哚（I811713，上海麦克林生化科技有限公司）、磷酸盐缓冲液（P1032，北京索莱宝科技有限公司）、QIAamp DNA Stool Mini Kit（51604，Qiagen）、pGEM-T Easy载体（P32026，Promega）、Golden Easy PCR System（KT221，天根生化科技(北京)有限公司）。1.2试验设计及饲养管理高邮鸭购自江苏高邮鸭发展集团有限公司。选取17日龄健康的高邮鸭280只，随机分为4组，每组5个重复，每个重复14只，公、母各半。对照组高邮鸭饲喂基础日粮，试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别在基础饲粮上添加100、250、400 mg/kg吲哚（纯度为99.5%）。基础饲粮按照周根来等[24]方法配制，为玉米-豆粕型饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表1，预混料购自正大集团。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.009.T001表1基础饲粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米60.00代谢能/(MJ/kg)12.45麦麸3.00粗蛋白/%18.31豆油1.00粗脂肪/%3.19豆粕20.00钙/%0.91玉米蛋白粉7.41磷/%0.45石粉1.67磷酸氢钙1.08食盐0.40赖氨酸0.41蛋氨酸0.03预混料5.00注：营养水平中代谢能是计算值，其余均为实测值。预试期5 d，试验鸭从22日龄开始笼养，正式试验期28 d。饲养试验在中崇信诺生物科技泰州有限公司进行，试验鸭自由采食、饮水，开展相同的免疫程序和饲养管理。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能参照周根来等[24]方法测定高邮鸭的生长性能，计算试验期各组鸭平均日增重、平均日采食量和料重比。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=总采食量/试验天数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.3.2血清生化指标试验最后1 d，采集试验鸭全血，全血经室温静置离心，收集血清，采用全自动生化分析仪（D280，英诺华）检测血清总胆红素（TBILI）、直接胆红素（DBILI）、尿酸（UA）含量及谷丙转氨酶（ALT）活性。1.3.3肠道组织样本采集和肠形态指标试验最后1 d，每个重复随机抽取体重接近的2只鸭屠宰，共40只。采集屠宰鸭十二指肠、空肠和回肠组织各2 cm，每只屠宰鸭三个肠段的采样部位基本一致，即十二指肠位置（U字型区域）、空肠位置（卵黄囊憩室上方约1 cm）和回肠位置（回肠中端）。使用0.9%生理盐水冲洗肠道组织，去除肠道表面污物和残余食糜，浸泡在10%中性甲醛溶液中48 h，其中24 h换液1次。固定后的肠组织浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片处理（切片厚度4~5 μm），苏木精-伊红（HE）染色，使用中性树胶封片。使用光学显微镜观察选择组织标本小肠形态清晰的视野5处，使用Image-Proplus6.0 软件测定组织样本肠绒毛高度（VH）、隐窝深度（CD）及绒毛高度与隐窝深度比值（VH/CD）。1.3.4盲肠菌群基因绝对定量real-time PCR（AQ-PCR）扩增1.3.4.1盲肠内容物采集和总DNA提取无菌条件下采取高邮鸭盲肠内容物2~3 g于1.5 mL灭菌冻存管中保存，经液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中保存。盲肠内容物总DNA提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒进行测定。使用紫外分光光度计测定DNA的OD260 nm值、OD280 nm值及OD260 nm/OD280 nm值，计算DNA的纯度和浓度。1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，-80 ℃冰箱保存。1.3.4.2盲肠菌群基因标准品制备引物分别扩增总细菌[25]、乳酸菌[26]、大肠杆菌和产气荚膜梭菌基因[27]序列，扩增引物序列见表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.009.T002表2扩增引物序列菌群引物序列（5'→3'）引物长度/bp总细菌F：GCAGGCCTAACACATGCAAGTC；R：CTGCTGCCTCCCGTAGGAGTF：22/R：20乳酸菌F：TGGAAACAGRTGCTAATACCG；R：GTCCATTGTGGAAGATTCCCF：21/R：20大肠杆菌F：GTTAATACCTTTGCTCATTGA；R：ACCAGGGTATCTAATCCTGTTF：21/R：21产气荚膜梭菌F：ATGATTGGGATTATGCAGCAA；R：TCCATCCTTTGTTTTGATTCCAF：21/R：22PCR 25 μL的反应体系：DNA（10 ng）1 μL、上下游引物（10 µmol/L）各1 µL、2×Reaction Mix 12.5 µL、Golden DNA聚合酶（0.5 U）0.25 µL，ddH2O补足至25 µL。PCR反应程序为：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s和72 ℃ 1 min，30次循环，72 ℃ 5 min。扩增产物经琼脂糖凝胶试剂盒回收后连接pGEM-T Easy载体在4 ℃过夜，连接产物转化感受态细胞（JM109菌）克隆后涂板于含氨苄西林（50 g/L）的LB平板培养基。挑取白色充分显色的单菌落接种于5 mL含氨苄西林（50 g/L）的LB培养液中连续培养12 h，根据宝生物（大连）公司的质粒快速提取试剂盒说明书提取质粒，将测序正确的重组质粒作为标准质粒，利用微量紫外分光光度计测定质粒的浓度和纯度，计算标准质粒拷贝数。拷贝数(copies/μL)=(6.02×1023)×核酸浓度(ng/µL)/平均分子量(g/mol)(4)1.3.5标准曲线的建立标准质粒稀释为8个10倍的倍比浓度梯度，分别为103~1010 copies/µL，稀释的标准样进行Real-time PCR扩增，每个梯度做3次重复。Real-time PCR反应按照以下反应体系和程序扩增，20 μL的反应体系：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O补足至20 μL。反应程序为：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40个循环，根据荧光检测结果绘制4种标准曲线。1.3.6盲肠总细菌、乳酸菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌基因拷贝数检测4个不同的标准品分别与待测样品同时进行Real-time扩增，根据待测样品的Ct值，结合标准曲线分析待测样品DNA拷贝数，计算拷贝数（X0）。Ct=-k logX0+b (5)每克样品拷贝数=X0×50 μL(洗脱体积)/肠道内容物重量 (6)式中：k为标准曲线斜率；b为标准曲线截距。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1吲哚对高邮鸭生长性能的影响（见表3）由表3可知，试验Ⅲ组鸭的平均日增重高于其他试验组（P0.05）。试验Ⅱ组鸭平均日采食量分别比对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅲ组低19.4%、17.2%和16.7%（P0.05）。试验Ⅱ组鸭的料重显著低于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.009.T003表3吲哚对高邮鸭生长性能的影响组别初重/kg末重/kg平均日增重/[(g/只·d)]平均日采食量/[(g/只·d)]料重比对照组0.367±0.0260.923±0.08919.857±0.12336.750±0.267a1.851±0.135a试验Ⅰ组0.376±0.0220.926±0.16519.642±0.25635.751±0.282a1.820±0.322a试验Ⅱ组0.347±0.0320.928±0.09420.751±0.34829.607±0.218b1.427±0.809b试验Ⅲ组0.352±0.0260.945±0.07821.179±0.87635.536±0.499a1.678±0.536a注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4与此同。2.2吲哚对高邮鸭血清生化指标的影响（见表4）由表4可知，试验Ⅲ组鸭TBILI、DBILI和UA均显著或极显著高于其他组（P0.05或P0.01），试验Ⅱ组鸭ALT活性显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.009.T004表4吲哚对高邮鸭血清生化指标的影响组别TBILI/(μmol/L)DBILI/(U/L)ALT/(U/L)UA/(mmol/L)对照组14.910±0.495Bb4.630±1.513b23.620±2.036b271.540±25.626Aa试验Ⅰ组17.020±0.198Bb6.470±0.919b30.700±2.134b549.700±58.087Aa试验Ⅱ组17.160±0.113Bb6.050±0.863b50.220±1.144a515.010±61.517Aa试验Ⅲ组22.900±1.366Aa8.500±2.241a28.630±0.720b766.160±63.244Bb注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01）。2.3吲哚对高邮鸭十二指肠、空肠和回肠形态的影响（见表5、图1）由表5可知，试验Ⅱ组母鸭十二指肠绒毛高度显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.009.T005表5吲哚对高邮鸭十二指肠、空肠和回肠形态的影响肠段项目试验Ⅰ组试验Ⅱ组试验Ⅲ组对照组P值十二指肠绒毛高度/μm公鸭220.422±62.11248.24±31.46238.02±70.40212.55±23.620.204母鸭266.61±38.55ab281.36±34.23a214.24±48.18ab209.60±46.90b0.019隐窝深度/μm公鸭85.13±26.8693.00±17.3477.95±21.3987.19±18.620.717母鸭84.00±18.6985.32±19.7481.14±24.0581.57±19.080.981绒毛高度/隐窝深度公鸭2.59±0.302.74±0.613.05±0.452.50±0.590.062母鸭3.51±0.923.33±1.182.76±0.672.58±0.590.306空肠绒毛高度/μm公鸭253.07±49.63291.24±59.28287.78±57.51223.67±55.160.338母鸭246.04±59.21187.62±51.23199.18±43.17231.46±59.160.435隐窝深度/μm公鸭62.44±8.9475.25±9.3770.23±7.7168.64±7.080.537母鸭62.75±11.8657.47±11.0278.27±11.5166.30±14.190.087绒毛高度/隐窝深度公鸭4.68±0.693.87±0.804.08±0.553.30±0.610.388母鸭4.06±1.253.17±1.142.62±0.833.56±0.900.207回肠绒毛高度/μm公鸭190.33±56.01191.89±63.36224.96±44.85181.66±43.800.522母鸭203.08±50.56228.91±49.90170.04±43.99205.17±52.220.339隐窝深度/μm公鸭57.41±18.5562.07±13.1352.61±14.9861.09±17.890.736母鸭68.23±27.5153.30±5.5255.51±13.3248.27±8.790.284绒毛高度/隐窝深度公鸭3.77±1.903.05±1.23a4.32±1.61b3.23±1.220.362母鸭3.49±1.714.31±1.283.26±1.174.33±1.040.435注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表6与此同。由图1可知。与对照组相比，试验Ⅱ组公、母鸭十二指肠绒毛伸展状态良好，绒毛间边界清晰，绒毛排列整齐。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.009.F001图1高邮鸭十二指肠绒毛形态的HE染色结果2.4高邮鸭盲肠不同菌群的Real-time PCR标准曲线（见图2）根据不同菌群，分别挑取标准样总细菌16S基因5个浓度梯度（105~109 copies/µL），乳酸菌基因5个浓度梯度（103~107 copies/µL）、大肠杆菌基因5个浓度梯度（104~108 copies/µL）和产气荚膜梭菌基因6个浓度梯度（104~109 copies/µL）稀释的标准品进行Real-time PCR扩增，标准品检测荧光结果分别绘制不同的标准曲线。由图2可知，总细菌16S回归方程为y=-3.36x+35.88，R2=0.998 2，扩增效率（E）=0.984；乳酸菌回归方程为y=-3.38x+34.48，R2=0.998 7，E=0.976；大肠杆菌回归方程为y=-3.62x+38.84，R2=0.995 7，E=0.889；产气荚膜梭菌回归方程为y=-3.54x+39.23，R2=0.997 9，E=0.916，表明4种方程线性关系良好，无特异性扩增，建立的绝对定量Real-time PCR方法满足特定菌群定量检测需要。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.009.F002图2高邮鸭盲肠不同菌群的Real-time PCR标准曲线2.5高邮鸭盲肠菌群的基因拷贝数定量分析结果（见表6）由表6可知，公、母鸭总细菌、乳酸菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌数量在各组间差异均不显著（P0.05）。各试验组公、母鸭中乳酸菌数量最高，产气荚膜梭菌数量均最低，试验Ⅱ组公、母鸭乳酸菌数量最高。试验Ⅱ组公、母鸭的产气荚膜梭菌数量均低于对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.009.T006表6高邮鸭盲肠菌群的基因拷贝数菌群性别试验Ⅰ组试验Ⅱ组试验Ⅲ组对照组P值总细菌公鸭1.73×1011±4.08×10102.85×1011±3.24×10102.46×1011±9.37×10102.15×1011±4.82×10100.456母鸭2.15×1011±1.08×10102.03×1011±4.46×10102.90×1011±2.50×10101.78×1011±4.51×10100.537乳酸菌公鸭3.59×109±1.42×1091.11×1010±4.82×1094.76×109±3.17×1091.02×1010±2.63×1090.323母鸭8.35×109±4.05×1098.81×109±2.28×1094.60×109±2.36×1097.12×109±5.05×1090.685大肠杆菌公鸭3.94×108±2.62×1081.70×109±1.86×1091.91×109±1.39×1095.49×108±3.95×1080.341母鸭2.27×108±1.44×1082.96×108±1.88×1085.49×108±3.95×1084.96×108±2.95×1080.708产气荚膜梭菌公鸭4.54×106±2.29×1065.00×106±4.30×1053.89×106±2.89×1061.01×107±4.38×1060.761母鸭3.20×106±1.59×1064.27×106±2.76×1062.23×106±1.71×1065.72×106±1.35×1060.309平均拷贝数/g3讨论3.1吲哚对高邮鸭生长性能的影响动物肠道形态与肠道功能相关，能够反映动物营养消化吸收状况。研究表明，肠绒毛高度能够影响肠绒毛的表面积，绒毛高度增加利于肠道营养物质的消化吸收[28]。本研究发现，饲喂吲哚的高邮鸭的十二指肠绒毛高度均高于对照组，而添加250 mg/kg吲哚母鸭的十二指肠绒毛高度显著高于对照组，表明吲哚可能影响高邮鸭十二指肠形态。绒毛高度/隐窝深度比值能够综合反映肠道对营养物质的消化吸收能力，绒毛高度/隐窝深度比值增加表明肠道吸收能力越强[29]。本研究发现，公母鸭十二指肠绒毛高度/隐窝深度比值均高于对照组，表明吲哚对鸭十二指肠消化吸收功能具有一定影响；本试验饲粮添加250 mg/kg吲哚对鸭的平均日采食量和料重比具有显著影响。结合本研究肠形态指标分析，添加250mg/kg吲哚鸭的三个肠形态指标均较高，表明添加250 mg/kg吲哚鸭营养消化吸收效率可能较高，从而改善了高邮鸭的饲料转化率，在一定程度上提高了高邮鸭的生长性能。3.2吲哚对高邮鸭血清生化指标的影响TBILI、DBILI和ALT主要反映肝脏健康状况。本研究发现，试验组鸭TBILI、DBILI、ALT和UA指标均高于对照组，其中试验Ⅲ组鸭TBILI和DBILI含量显著高于其他组，试验Ⅱ组鸭ALT活性显著高于其他组，表明随着吲哚含量升高，鸭肝脏存在肝损伤的风险，具体原因有待进一步研究。血清中UA含量变化反映肾脏健康状况，部分反映氨基酸和蛋白质代谢变化。本研究中，试验Ⅲ组鸭UA含量极显著高于其他组，表明吲哚含量升高影响鸭尿酸值，提示吲哚含量升高，鸭肾脏存在损伤风险。但本研究中，试验Ⅱ组鸭血清UA含量与对照组无明显差异，表明试验Ⅱ组吲哚的添加量对鸭肾脏健康影响有限。3.3吲哚对高邮鸭肠道特定菌群数量的影响动物肠道菌群包括吲哚生成菌和非吲哚生成菌，而吲哚主要通过体内吲哚生产菌的色氨酸代谢途径完成，目前已发现85种吲哚生成菌利用色氨酸产生吲哚[30]。本研究发现，盲肠总细菌数量随吲哚浓度增加有升高趋势响。研究表明，拟杆菌属在笼养高邮鸭粪便和盲肠内容物中是绝对优势菌属[31]。本研究中，试验高邮鸭为笼养方式，推测饲养方式和吲哚水平能够影响本研究盲肠总细菌数，而总细菌数量升高可能与拟杆菌属增殖有关[32]。由于乳酸菌和大肠杆菌自身能够合成吲哚，而外源添加吲哚导致肠道吲哚含量增加，推测鸭肠道吲哚水平可能影响乳酸菌、大肠杆菌代谢功能进而调节各自群体增殖，过量吲哚能够抑制色氨酸酶（TnaA）活性而逆向影响产吲哚菌色氨酸代谢途径[33]。研究发现，添加外源吲哚能够影响产气荚膜梭菌数量，进一步分析发现试验组高邮鸭的产气荚膜梭菌数量均低于乳酸菌，产气荚膜梭菌自身不能产生吲哚，推测吲哚可能抑制有害菌繁殖，从而促进有益菌繁殖，原因可能是吲哚能够减小非产生吲哚菌对产生吲哚菌的生物竞争[34]，但吲哚如何协调鸭肠道菌群之间的相互作用影响肠道菌群生态还需要进一步研究。4结论本试验条件下，吲哚能够改善高邮鸭的生长性能、血清生化指标、不同肠段肠形态和盲肠菌群结构。添加250 mg/kg吲哚对改善高邮鸭肠道健康最有利。