在“粮改饲”推动下，我国苜蓿年产量持续增加，进口量逐年下降[1]。紫花苜蓿被称为“牧草之王”，可作青饲、青贮、青干草和草粉，对畜禽的饲喂效果较好[2]。但紫花苜蓿存在化感作用，研究紫花苜蓿种内和其他牧草间的相互影响，对扩大种植面积、增加产量、合理布局具有重要作用。植物化感物质是植物的次生代谢产物，可以进入环境对其他作物产生影响[3-4]。这些化感物质会促进或抑制其他植物生长，因此研究植物的化感作用对植物种间、种内的相互作用具有重要意义[5]。水杉落叶中的化感物质在落叶分解过程中释放到根际中，抑制附近植物的生长，从而为自身提供生长优势[6]。杨彤等[5]研究距紫花苜蓿根不同深度的土壤提取液对蜀葵种子萌发以及生理指标的影响，发现随根际距离增加，有机酸浓度降低，发芽率、发芽指数及根苗根长均有所降低。豆科牧草和禾本科牧草混播的产量比单播更高、更稳定，紫花苜蓿与多年生黑麦草效果更佳[7]。多年生黑麦草可作为鲜草、干草或制作青贮饲料饲喂鹅、兔、牛、羊、猪，能够促进动物消化，降低饲养成本，从而提高养殖经济效益[8]。为了使两种牧草能够更好地混播、轮作，发挥两种牧草的适应性和抗逆性，研究紫花苜蓿对多年生黑麦草种子萌发过程的化感作用具有重要意义。本试验采用培养皿滤纸法，研究紫花苜蓿wl-963-HQ地上部（茎、叶）和地下部（根）不同浓度浸提液多年生黑麦草种子萌发过程及幼苗生长的影响，对紫花苜蓿的化感作用进行评价，为紫花苜蓿与多年生黑麦草的混播、轮作及实现饲草的优质高产提供参考。1材料与方法1.1试验材料紫花苜蓿wl-963-HQ种子和多年生黑麦草种子购自郑州华丰有限公司。1.2试验设计1.2.1紫花苜蓿种植试验在河南科技大学牧场进行，小区面积2 m×1 m，采用随机区组，3次重复。播种量22.5 kg/hm2。田间管理按照大田常规管理办法。1.2.2浸提液的制备在紫花苜蓿盛花期进行收割，将根、茎、叶分开，分别剪成2 cm小段，在室内晾干，粉碎机粉碎，3次重复。分别取根、茎、叶40 g，加入1 000 mL蒸馏水，浸泡48 h过滤，二重过滤，第一次使用定性滤纸，第二次用单位为0.45 μm滤膜，得到40 g/L母液。将母液用蒸馏水稀释至2.5、5.0、10.0和20.0 g/L，置于4 ℃冰箱保存[9]。1.2.3种子萌发及幼苗生长试验选取种皮完整、大而饱满的多年生黑麦草种子，次氯酸钠消毒10 min，分别使用自来水和蒸馏水冲洗数次，滤纸吸干表面水分[10]。选用直径9 cm的培养皿，培养皿中垫两层滤纸，每个培养皿中放50颗种子，分别加入20 mL不同浓度的紫花苜蓿浸提液，对照组加入等量的蒸馏水，每个处理重复4次，置于25 ℃光暗交替（12 h/12 h）、相对湿度为65%光照培养箱中培养，观察种子发芽情况，及时补充蒸馏水，保持滤纸湿润，每24 h记录种子发芽数。1.3测定指标及方法1.3.1生长指标计算种子的苗高、根长、苗重、发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数。苗高和根长取所有种子苗高、根长的平均值[10]。苗重=10根全株湿重/10(1)发芽率=12 d已发芽种子数/全部种子数×100%(2)发芽势=7 d内发芽种子数/受试种子数×100%(3)发芽指数=∑（Gt/Dt）(4)式中：Gt为第t d种子发芽的数量，Dt为发芽试验的第t d。活力指数=S×发芽指数(5)式中：S为幼苗生长量（长度）。1.3.2生理指标试验15 d后测定生理指标，采用可见光法测过氧化氢酶（CAT）活性，采用愈创木酚比色法测定过氧化物酶（POD）活性[11]，采用95%乙醇提取分光光度法测定叶绿素含量[12]。检测试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司。1.4数据统计与分析采用Microsoft Excel 2019软件制图，SPSS 22.0统计软件对数据进行单因素方差分析，Duncan's法多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同浓度紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草种子萌发的影响2.1.1紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草种子发芽率和发芽势的影响（见图1）由图1可知，紫花苜蓿的根、茎、叶浸提液4种浓度梯度对多年生黑麦草种子的发芽率和发芽势均具有明显的抑制作用。根的浸提液浓度为20.0 g/L时，多年生黑麦草发芽率比对照组降低了92.1%；叶的浸提液浓度为20.0 g/L时，发芽势与对照组相比降低了97.8%；随着3个部位浸提液浓度增加，抑制作用越明显，表明提取液浓度越高，多年生黑麦草的耐受力越差。图1紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草种子发芽率和发芽势的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.022.F1a1（a）发芽率10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.022.F1a2（b）发芽势2.1.2紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草种子发芽指数和活力指数的影响（见图2）由图2可知，紫花苜蓿根、茎、叶浸提液浓度越高，多年生黑麦草种子发芽指数和活力指数越低。当根和叶浸提液浓度为20.0 g/L时，黑麦草种子基本无法正常发芽。与对照组相比，当根、茎、叶浸提液浓度为20.0 g/L时，多年生黑麦草种子发芽指数分别下降96.6%、44.6%和95.2%。结果表明，紫花苜蓿根和叶浸提液对多年生黑麦草种子发芽的抑制作用较茎浸提液更明显。图2紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草种子发芽指数和活力指数的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.022.F2a1（a）发芽指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.022.F2a2（b）活力指数2.2紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗生长的影响2.2.1紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗根长和苗高的影响（见图3）由图3可知，紫花苜蓿根和茎浸提液对多年生黑麦草幼苗根长影响不明显，但低浓度的叶浸提液对多年生黑麦草幼苗根长具有明显的促进作用。与对照组相比，不同部位的紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草苗高均无明显影响。研究表明，不同部位的紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗的根长和苗高均无抑制作用。图3紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗根长和苗高的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.022.F3a1（a）根长10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.022.F3a2（b）苗高2.2.2紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗苗重的影响（见图4）由图4可知，不同浓度的紫花苜蓿浸提液对苗重均有明显影响。紫花苜蓿不同部位浸提液对多年生黑麦草幼苗苗重的影响不同。紫花苜蓿根和叶浸提液在浓度为20.0 g/L时，多年生黑麦草幼苗苗重分别比对照组增加了41.7%、27.8%；茎浸提液浓度为20.0 g/L时，多年生黑麦草幼苗苗重比对照组降低了33.3%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.022.F004图4紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗苗重的影响2.3紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗生理指标的影响2.3.1紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗叶绿素含量的影响（见表1）由表1可知，与对照组相比，紫花苜蓿根、茎、叶的浸提液显著降低了多年生黑麦草幼苗叶绿素含量（P0.05）。紫花苜蓿根浸提液浓度为5.0 g/L时，对多年生黑麦草幼苗叶绿素含量抑制效果最大；紫花苜蓿茎、叶浸提液浓度为20.0 g/L时，对多年生黑麦草幼苗叶绿素含量抑制效果最大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.022.T001表1紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗叶绿素含量的影响浸提液浓度/(g/L)根茎叶0（对照组）3.08±0.24a3.08±0.24a3.08±0.24a2.51.06±0.01c0.76±0.01d0.92±0.00c5.00.68±0.01d0.88±0.01cd0.82±0.01cd10.01.11±0.01c1.25±0.03b1.19±0.00b20.01.41±0.09b0.99±0.00c0.71±0.04d注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mg/g FW2.3.2紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗POD活性的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，各浓度紫花苜蓿根、茎、叶的浸提液多年生黑麦草幼苗POD的活性显著增强（P0.05）。紫花苜蓿根浸提液对多年生黑麦草幼苗POD活性的作用明显，当根浸提液浓度为20.0 g/L时，多年生黑麦草幼苗POD活性最高，显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.022.T002表2紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗POD活性的影响浸提液浓度/(g/L)根茎叶0（对照组）23.74±0.00b23.74±0.00b23.74±0.00b2.5224.60±13.41ab139.42±14.20a144.70±63.81a5.0157.36±71.72ab144.25±24.98a66.03±28.59ab10.0193.50±122.97ab124.60±65.93a84.92±13.37ab20.0264.12±187.53a109.10±14.54a138.80±83.41aU/(g·min) FW2.3.3紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗CAT活性的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，紫花苜蓿根、叶的浸提液对多年生黑麦草幼苗的CAT活性无显著影响（P0.05）；紫花苜蓿茎浸提液为10.0、20.0 g/L时，多年生黑麦草幼苗的CAT活性显著增加（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.022.T003表3紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草幼苗CAT活性的影响浸提液浓度/(g/L)根茎叶0（对照组）13.73±10.3913.73±10.39b13.73±10.392.517.44±13.4225.65±18.79ab21.88±33.955.028.70±16.056.35±3.72b17.51±22.4610.026.69±21.6243.48±20.49a49.85±28.8420.09.88±2.2146.21±16.40a21.16±5.14U/(g·min) FW3讨论植物的化感作用主要通过对受体植物种子萌发和幼苗生长产生影响，受体所受的化感效应与供体植物部位和浸提液浓度有关。植物化感作用受遗传因素、植物生长状况、环境因素以及生物因素的影响[13]，通常可以通过发芽试验、幼苗生长试验、盆栽试验和大田试验研究植物化感作用[14]。短尾铁线莲茎的浸提液对刺槐根系超氧化物歧化酶（SOD）和CAT活性的作用高于根和叶的浸提液[15]。核桃叶水浸提液浓度低于25 g/L时，对草珊瑚种子萌发和幼苗生长具有促进作用，浓度为5 g/L时促进效果最大[16]。核桃叶片的浸提液浓度小于0.04 g/L，对小麦种子萌发具有促进作用，大于0.04 g/L时具有抑制作用[17]。本研究显示，紫花苜蓿wl-963-HQ不同部位的浸提液均对多年生黑麦草种子萌发具有显著的化感作用，紫花苜蓿浸提液浓度越高，种子发芽率和发芽势越低，抑制作用越明显。发芽指数是种子的活力指标[18]，紫花苜蓿wl-963-HQ浸提液的浓度对多年生黑麦草的发芽指数具有显著影响，浓度越高，发芽指数越低。根浸提液浓度为20.0 g/L时，发芽指数比对照组相比下降了96.6%。因此，紫花苜蓿对多年生黑麦草种子发芽基本表现为抑制作用，与孙林等[19]试验结果基本一致。本研究中，紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草种子发芽过程影响效果不一致，总体表现为根叶茎；当根浸提液浓度为20.0 g/L时，多年生黑麦草种子基本不发芽，种子霉烂，表明根浸提液中化感物质含量多，对多年生黑麦草种子活力产生致命伤害。叶绿素是植物光合作用不可缺少的物质[20]，同时也参加生物合成代谢，其含量直接影响植物对光能的利用。化感物质对植物细胞具有一定的损害作用，使植物叶绿素受到影响。在紫花苜蓿土壤提取液对蜀葵化感作用中，间作时叶绿素合成受到抑制[5]。本试验中，紫花苜蓿wl-963-HQ根、茎、叶浸提液均对叶绿素合成具有抑制作用，与上述结果类似。植物处于逆境中，由于代谢紊乱产生过量的活性氧造成氧化胁迫[21]，抗氧化酶系统能够减缓氧化速度，是重要的防御体系，CAT和POD可将过氧化氢分解为水和氧气，减少胁迫引起的损害。多年生黑麦草在遮阴胁迫和重金属铬、铅的胁迫下，POD和CAT活性增强[22-23]。本试验中，在紫花苜蓿wl-963-HQ化感物质的胁迫下，POD活性显著增强，CAT活性也呈不同程度地升高。本试验中，浸提液浓度为20.0 g/L时，多年生黑麦草幼苗生长困难，根部出现霉烂。推测可能可能是浸提液浓度越高，化感物质越多；或是根部直接接触浸提液，更容易受到化感物质毒害。但本试验仅在室内进行，未能考虑其他自然与非自然因素的干扰，因此对紫花苜蓿wl-963-HQ和多年生黑麦草的化感作用还需室内与室外结合进一步研究。4结论本试验条件下，紫花苜蓿wl-963-HQ根、茎、叶的浸提液对多年生黑麦草种子发芽和幼苗生长具有抑制作用。紫花苜蓿浸提液可激活多年生黑麦草幼苗抗氧化酶系统，增强POD、CAT活性。不同部位紫花苜蓿浸提液对多年生黑麦草种子发芽和幼苗生长影响效果不一致，总体表现为根叶茎。不同部位紫花苜蓿浸提液浓度达到20 g/L时，多年生黑麦草幼苗无法正常发芽和生长。