奶牛适宜的体感温度为5~25 ℃，夏季高温、高湿和热辐射会造成奶牛热应激，导致奶牛采食量下降、代谢紊乱、生产性能降低、发生乳房疾病和繁殖疾病等。因此，缓解热应激、维持奶牛持续高产是目前研究的重点。黄酮类化合物是一类具有抗炎和抗氧化功能的多酚，在奶牛中补充黄酮类化合物可增加奶牛的产奶量，降低牛奶中体细胞数，减少奶牛乳腺炎的发生率，但由于剂量、特定化合物功效等不同，不同类黄酮对奶牛的作用效果也不同[1]。黄芩苷作为一种黄酮类化合物，是中药黄芩的主要有效成分，具有抗菌[2]、抗炎[3-4]、调节机体免疫[5-6]和抗氧化应激[7]等生物学功能，但黄芩苷存在结构不稳定、易被氧化、口服吸收差、生物利用度低等问题，限制了其在动物生产中的使用。本试验在夏季奶牛基础饲粮中添加黄芩苷制剂，探讨黄芩苷对夏季奶牛生产性能、乳品质、血清指标和经济效益的影响，以期为黄芩苷在奶牛养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料黄芩苷制剂为江西兴鼎科技有限公司提供，有效成分为4%黄芩苷，其余成分为稻壳粉等载体。黄芩苷制剂为项目组前期研制，采用分子包合技术处理，通过本实验室数据以及委托江西农业大学动科院联合研究的数据表明，经处理后的黄芩苷制剂稳定性好，体外大肠杆菌攻毒试验证实其具有良好的抗氧化效果和抗炎效果。1.2试验动物试验动物为河南某牧场提供的胎次（2.65±0.95）、产奶量（33.96±1.35）kg、泌乳天数（179.66±6.58）d的中国荷斯坦泌乳奶牛。1.3试验设计试验采用完全随机试验设计，将体况良好的健康荷斯坦奶牛80头，随机2组，每组40头奶牛，每重复1头奶牛。对照组奶牛饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中添加10 g/(头·d)黄芩苷制剂。预试期7 d，正式试验期60 d。试验牛饲喂全混合饲粮（TMR），基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.004.T001表1基础饲粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00全株青贮45.12产奶净能/(MJ/kg)6.67玉米黄贮15.72粗纤维/%19.44玉米粉10.38中性洗涤纤维/%35.62压片玉米3.16酸性洗涤纤维/%18.56羊草5.33粗蛋白质/%16.72苜蓿2.60粗脂肪/%4.23棉籽4.46钙/%0.90甜菜粕3.02磷/%0.51豆粕7.66小苏打0.55预混料2.00注：1.每千克预混料为饲粮提供：VA 820 000 IU、VD 300 000 IU、VE 10 000 IU、钴20 mg、锰8 000 mg、铜8 000 mg、铁20 000 mg、锌7 500 mg、硒20 mg、碘120 mg。2.营养水平中产奶净能为计算值，其余均为实测值。1.4饲养管理试验时间为2021年6月13日~8月18日。试验牛群采用散栏饲养模式饲养于同一栋牛舍，每天饲喂3次（7：00、13：30和19：30），挤奶3次（6：30、13：00和19：00），自由饮水。试验期间，所有参试奶牛由专人进行饲养管理，其他日常管理按常规进行。1.5测定指标及方法1.5.1牛舍温湿指数（THI）与牛直肠温度试验期间，利用舍内固定点的电子温湿度计测定每天8：00、14：00和20：00温度（T，℃）和相对湿度（RH，%），计算平均THI。试验期间，每周利用兽用体温计测定试验牛的直肠温度，每组每次抽测20头牛，计算平均直肠温度。THI＝(1.8×T+32)-0.55×(1-RH)×(1.8×T-26)(1)1.5.2生产性能试验期间，记录每组牛群当天TMR投料量、剩料量，测定干物质含量，计算平均日干物质采食量。试验期间，记录每头奶牛的早、中、晚产奶量，计算各组奶牛平均日产奶量，料奶比。平均日干物质采食量=总干物质采食量/试验天数(2)平均日产奶量=总产奶量/试验天数(3)料奶比=平均日干物质采食量/平均日产奶量(4)1.5.3乳品质分别在试验开始和试验结束采集早、中、晚奶样，按4∶3∶3比例混合均匀，置于40 mL已添加防腐剂（重铬酸钾饱和液）的采样瓶中。采用Lactoscan S牛奶分析仪测定牛奶的乳脂、乳蛋白、乳糖和非脂乳固体含量，采用KD-400牛奶体细胞数量检测计数仪测定各组奶牛乳体细胞数。1.5.4乳房炎发病率根据奶牛乳体细胞数及临床症状表现，计算各组奶牛乳房炎发病率。乳房炎发病率=隐性乳房炎患牛头数/总头数×100%(5)1.5.5血清指标试验最后1 d晨饲前，对各组奶牛进行尾根静脉采血，4 ℃、3 000r/min离心15 min，取上层血清，置于-20 ℃冰箱中保存。测定血清指标包括：肌酸激酶（CK）、皮质醇（COR）、葡萄糖（GLU）；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA），免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。ALT和AST使用全自动电化学发光仪按照说明书检测，COR和CK使用全自动放射免疫仪按照说明书测定，GLU、SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA使用酶标仪（RT-6000）按照说明书检测，IgG和IgA使用免疫透色比浊法测定，IL-lβ、TNF-α及IL-6使用ELISA法测定。试验COR和CK试剂盒购自江苏酶免实业有限公司，其余试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。1.5.6经济效益分析试验结束后，根据奶牛平均干物质采食量和平均日产奶量、鲜奶产值、黄芩苷添加成本计算饲粮成本、毛利润和增收效益。饲粮成本[元/(头·d)]=TMR饲粮价格×平均干物质采食量(6)鲜奶产值[元/(头·d)]=鲜奶收购价×平均日产奶量(7)黄芩苷成本[元/(头·d)]=黄芩苷添加量×价格(8)利润[元/(头·d)]=鲜奶产值-饲粮成本-黄芩苷添加成本(9)增收效益[元/(头·d)]=试验组利润-对照组利润(10)1.6数据统计与分析试验数据采用Excel 2021软件进行统计，SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1试验期牛舍温湿指数及黄芩苷对试验牛直肠温度的影响（见图1、表2）按照West等[8]的方法判定奶牛热应激水平，当牛舍THI70时，奶牛不发生热应激；当牛舍THI位于70~79范围时，奶牛出现轻微热应激。由图1可知，7月4日之后至试验结束，试验牛群处于轻微热应激环境，两个处理组牛舍THI无明显差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.004.F001图1牛舍温湿指数由表2可知，在试验中后期，饲粮添加黄芩苷可明显缓解热应激条件下奶牛直肠温度的上升。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.004.T002表2黄芩苷对试验牛直肠温度的影响组别6月20日6月27日7月4日7月11日7月18日7月25日8月1日8月8日8月15日对照组38.53±0.0838.65±0.1739.29±0.0839.43±0.0639.60±0.10a39.71±0.08a39.97±0.13a40.14±0.07a40.09±0.06a试验组38.48±0.1038.60±0.1238.77±0.0939.02±0.0638.81±0.07b38.78±0.06b39.10±0.12b39.13±0.08b39.07±0.09b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表3、表4、表5与此同。℃2.2黄芩苷对奶牛生产性能的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，试验组奶牛41~50 d和51~60 d的平均日干物质采食量显著增加（P0.05）；试验组奶牛在21~30 d、31~40 d、41~50 d和51~60 d的平均日产奶量显著增加（P0.05）。各阶段试验组奶牛的料奶比均低于对照组，其中31~40 d和41~50 d试验组奶牛的料奶比显著低于对照组（P0.05）。试验1~60 d，与对照组相比，奶牛的平均日干物质采食量提高了2.43%（P0.05），奶牛平均日产奶量显著提高了5.69%（P0.05），料奶比降低了2.56%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.004.T003表3黄芩苷对奶牛生产性能的影响项目1~10 d11~20 d21~30 d31~40 d41~50 d51~60 d1~60 d平均日干物质采食量/[kg/(头·d)]对照组24.98±1.1824.49±1.4424.16±1.7523.73±0.9323.08±2.06b22.62±1.63b23.84±1.02试验组24.41±0.9624.62±1.0824.25±1.3124.07±1.2224.46±1.01a24.73±0.74a24.42±0.86平均日产奶量[kg/(头·d)]对照组33.20±1.0132.06±1.9231.55±1.75b30.36±2.21b28.94±2.64b27.45±1.88b30.59±1.52b试验组33.58±1.2533.13±1.5732.84±0.91a32.53±1.33a31.39±1.24a30.50±0.89a32.33±1.21a料奶比对照组0.75±0.020.76±0.010.76±0.020.78±0.01a0.80±0.02a0.82±0.030.78±0.02试验组0.73±0.010.74±0.010.74±0.030.74±0.02b0.77±0.02b0.81±0.020.76±0.022.3黄芩苷对奶牛乳品质的影响（见表4）由表4可知，试验结束时，试验组牛奶的乳脂率和乳蛋白率显著高于对照组（P0.05），乳体细胞数显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.004.T004表4黄芩苷对奶牛乳品质的影响项目乳脂率/%乳蛋白率/%乳糖率/%非脂乳固体率/%乳体细胞数/(×104个/mL)试验开始对照组3.76±0.113.19±0.084.79±0.158.54±0.2227.7±8.63试验组3.69±0.073.17±0.124.74±0.118.63±0.1829.5±6.27试验结束对照组3.64±0.27b3.09±0.15b4.41±0.328.51±0.2934.64±6.05a试验组3.81±0.18a3.33±0.08a4.52±0.188.63±0.4226.57±4.07b2.4黄芩苷对奶牛乳房炎发病率的影响（见表5）由表5可知，试验期间，对照组有5头奶牛患隐性乳房炎（乳体细胞数50万个/mL），隐性乳房炎发病率为12.5%；试验组奶牛均正常，未发现隐性乳房炎病例。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.004.T005表5黄芩苷对奶牛乳房炎发病率的影响组别乳房炎发病数乳房炎发病率/%对照组512.50试验组002.5黄芩苷对奶牛血清生化、抗氧化、免疫指标的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，试验组热应激奶牛血清COR、CK和GLU含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.004.T006表6黄芩苷对奶牛血清生化、抗氧化、免疫指标的影响项目对照组试验组生化指标ALT/(U/L)26.23±3.1322.48±2.87AST/(U/L)75.19±8.2967.64±6.61COR/(μg/L)137.93±4.87a113.79±3.31bCK/(U/mL)8.74±0.36a8.05±0.24bGLU/(mmol/L)3.02±0.30a2.57±0.26b抗氧化指标SOD/(U/mL)95.22±7.68108.34±9.24GSH-Px/(U/mL)93.51±4.80b112.69±3.52aT-AOC/(U/mL)4.89±0.32b6.02±0.39aMDA/(μmol/L)3.41±0.34a2.80±0.25b免疫指标IgA/(g/L)3.75±0.544.40±0.71IgG/(g/L)16.66±3.21b24.72±2.79aIL-1β/(ng/L)484.31±40.23a360.25±36.55bTNF-α/(ng/L)412.04±33.10a343.61±24.14bIL-6/(ng/L)469.16±50.74a370.43±43.13b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。与对照组相比，试验组热应激奶牛血清GSH-Px活性和T-AOC显著提高（P0.05），MDA含量显著降低（P0.05）。与对照组相比，试验组热应激奶牛血清IgG含量显著提高（P0.05），IL-1β、TNF-α和IL-6含量显著降低（P0.05）。2.6黄芩苷对奶牛经济效益的影响（见表7）由表7可知，饲粮添加黄芩苷可提高奶牛养殖效益2.71元/(头·d)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.004.T007表7黄芩苷对奶牛经济效益的影响项目对照组试验组饲粮成本/[元/(头·d)]65.5667.16鲜奶产值/[元/(头·d)]128.48135.79黄芩苷添加成本/[元/(头·d)]0.003.00利润/[元/(头·d)]62.9265.63增收效益/[元/(头·d)]—2.71注：TMR饲粮单价为2.75元/kg，鲜奶收购价为4.2元/kg，黄芩苷价格为300元/kg。3讨论3.1黄芩苷对奶牛直肠温度的影响热应激可改变荷斯坦奶牛的生产和生理参数。Yan等[9]对826头荷斯坦牛的泌乳数据进行统计发现，奶牛直肠温度的THI阈值是69.8。本研究发现，随着试验期延长，牛舍THI逐渐升高，奶牛进入轻微热应激状态，对照组奶牛的直肠温度明显升高，饲粮添加黄芩苷可明显缓解轻微热应激条件下奶牛直肠温度的上升，降低奶牛直肠温度，这可能与黄芩苷的解热功能有关。研究表明，黄芩苷可通过抑制脂多糖（LPS），上调PBMC的TLR4信号，降低炎性细胞因子IL-1β和TNF-α含量的增加，从而发挥解热作用[10-12]。3.2黄芩苷对奶牛生产性能的影响黄芩苷是中药黄芩的主要活性成分。研究表明，饲料中添加含黄芩的中草药可增强奶牛抵抗热应激的能力，同时不影响奶牛的产奶性能[13]。赖雨宏等[14]研究发现，饲料中添加山花黄芩提取物散（绿原酸含量≥2.2 mg/g，黄芩苷含量≥22 mg/g）可提高奶牛产奶量。Robert等[15]研究表明，奶牛饲粮中添加黄芩提取物可提高奶牛产后60 d的产奶量。Olagaray等[16]研究发现，产犊后长期（60 d）补充黄芩提取物（含黄芩苷33%）可增加荷斯坦奶牛全期泌乳产量，降低牛奶体细胞数，对奶牛乳腺炎发病率也具有显著降低的作用，证实了黄芩提取物的抗炎效果。本研究表明，添加黄芩苷能够显著增加泌乳荷斯坦奶牛的平均日产奶量，提高饲料转化率，可能与黄芩苷的抗炎、抗氧化及缓解热应激作用有关，与上述研究结论一致。3.3黄芩苷对奶牛血清指标的影响ALT和AST可反映肝脏代谢功能的状态，是衡量奶牛健康水平的重要指标。本试验中，试验牛群处于轻微热应激环境，肝功能代谢并未受到影响；但添加黄芩苷对ALT和AST活性具有一定降低作用。血清COR和CK含量可作为奶牛热应激的评判指标，当奶牛处于热应激时，血液COR含量增加，热应激会导致细胞膜通透性升高，造成血液CK含量增加。本研究发现，与对照组相比，试验组奶牛血清COR和CK含量显著降低，表明添加黄芩苷可缓解奶牛热应激。作为乳糖的主要前体物，血液中的GLU可被乳腺上皮细胞利用，用于合成乳蛋白和乳脂。本研究表明，试验组奶牛GLU显著低于对照组，乳蛋白率和乳脂率显著高于对照组，表明更多葡萄糖被乳腺利用，与De Koster等[17]报道一致。夏季高温季节，高产奶牛容易发生与炎症密切相关的氧化反应，机体处于氧化应激状态。细胞可通过激活GSH-Px和SOD等抗氧化酶活性以对抗氧化应激。T-AOC可作为综合性指标反映机体的抗氧化能力，而MDA是自由基介导的最重要的脂质过氧化产物之一，可反映机体氧化损伤的程度。黄芩苷是具有抗炎和抗氧化功能的黄酮类化合物[18]，对LPS诱导的乳腺损伤具有显著的抗炎和抗氧化作用，可用于预防奶牛的氧化代谢紊乱。Perruchot等[19]研究表明，黄芩苷对牛乳腺细胞具有抗氧化作用，可通过减弱H2O2诱导的活性氧产生，增加Nrf2蛋白表达水平，提高过氧化氢酶活性，从而保护乳腺上皮细胞，改善乳腺细胞健康。研究表明，黄芩苷还可用作抗凋亡剂以减轻热应激诱导的细胞凋亡。本研究结果显示，试验组奶牛血清GSH-Px活性和T-AOC显著增加，血清MDA含量下降，表明黄芩苷提高了热应激状态下奶牛的抗氧化性能。免疫球蛋白是一类特异性抗体，是机体最重要的免疫成分，主要参与体液免疫，帮助机体清除细菌、病毒等抗原物质。IL-1β、TNF-α和IL-6是动物体内常见的促炎因子，可有效反映动物体内炎症程度。Guo等[20]建立金黄色葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎模型，结果发现，黄芩苷可通过降低促炎因子TNF-α、IL-β和IL-6的表达发挥抗炎作用，减轻葡萄球菌诱导的炎症。黄芩苷还可通过抑制NF-κB的激活和上调HSP72的表达减轻LPS诱导的牛乳腺上皮细胞炎症和细胞凋亡，从而提高细胞活力，预防奶牛乳腺炎[7]。本研究发现，饲粮补充黄芩苷可增加奶牛血清IgG浓度，降低血清IL-1β、TNF-α和IL-6浓度，表明黄芩苷可抑制炎症反应，提高机体免疫功能和热应激状态下奶牛的健康程度。3.4黄芩苷对奶牛乳品质的影响乳脂和乳蛋白是牛奶的主要营养成分，可作为衡量牛奶品质的重要指标。赖雨宏等[14]发现，在饲料中添加山花黄芩提取物散可提高牛奶乳蛋白率，对乳脂和乳糖含量无明显影响。Olagaray等[16]研究发现，奶牛饲粮中长期（60 d）补充黄芩提取物（含黄芩苷33%）可增加处理期内牛奶乳脂和乳糖产量，乳蛋白产量也有增加趋势。本试验结果表明，添加黄芩苷后，牛奶的乳脂率和乳蛋白率显著提高，可能与黄芩苷对奶牛乳腺健康的改善作用有关。本研究中，试验组牛奶体细胞数较对照组显著下降。而体细胞数增加表明乳腺存在炎症，乳腺炎症会降低腺体的合成能力，因此改善乳腺健康可增加牛奶产量，提高乳品质。Garavaglia等[21]研究发现，早期泌乳体细胞数的减少与乳脂、乳糖产量的增加以及产奶量的增加趋势一致。3.5黄芩苷对奶牛乳体细胞数及隐性乳房炎的影响牛奶体细胞数反映了乳腺感染和炎症状态，是在临床上判定隐性乳房炎的参考指标，可用于监测奶牛乳房健康状态和牛奶质量。在未感染奶牛的乳房中，体细胞数通常小于20万个/mL，较高的体细胞数通常预示细菌感染。有研究表明，饲粮补充黄芩苷可降低牛奶体细胞数，降低奶牛乳腺炎发病率[16]。此外，黄芩苷还可与其他中药配伍用于治疗奶牛乳房炎。黄芩苷不仅是中药复方制剂（芩红灌注剂）的指标性成分[22]，也是中药灌注剂的主要成分[23]。Perruchot等[19]研究发现，黄芩苷能够有效降低患病奶牛乳体细胞数，且未发现其会在牛奶中积累，可用于治疗奶牛临床乳腺炎。Burmańczuk等[24]也发现，黄芩苷可减轻LPS诱导的乳腺损伤，经乳房内给药黄芩苷可减少患有临床乳腺炎奶牛的体细胞数。本研究表明，饲粮中补充黄芩苷可显著降低牛奶体细胞数和奶牛隐性乳房炎发病率，对预防奶牛乳房炎感染具有明显效果，结果与上述研究相似。原因可能与黄芩苷的抗氧化和抗炎作用、保护乳腺上皮细胞免受损伤和抑制病原菌活性等有关。临床引起奶牛乳腺炎的致病菌有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。黄芩苷可有效抑制金黄色葡萄球菌的生长和生物膜形成，降低金黄色葡萄球菌毒性因子[25]，能够通过灭活NF-κB途径抑制由病原体或内毒素引起的炎症。体外培养试验发现，黄芩苷可抑制金黄色葡萄球菌黏附、入侵奶牛乳腺上皮细胞，从而缓解金黄色葡萄球菌诱导的细胞损伤[26]。金黄色葡萄球菌产生的杀白细胞素（PVL）可能与牛乳腺炎有关，而黄芩苷可抑制产PVL毒素的金黄色葡萄球菌和重组（r）PVL诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡[27]。Zhao等[2]表明，黄芩苷能够抑制从乳腺炎牛奶样品中分离出的大肠杆菌菌株，最小抑菌浓度（MIC）为4 g/L，影响大肠杆菌的耐药基因，间接增强大肠杆菌对氨苄西林、青霉素、链霉素、环丙沙星等抗菌药物的敏感性。3.6黄芩苷对奶牛经济效益的影响奶牛的产奶量和乳品质能够影响奶牛的经济效益。国农垦经贸流通协会发布的《中国农垦乳业联盟产品标准 生鲜乳》规定生鲜乳中体细胞数不得超30×104个/mL。本试验中，添加黄芩苷可有效降低夏季奶牛的乳体细胞数，提高产奶量和乳品质，从而提高奶源收益，直接提高奶牛养殖效益，在奶牛饲粮添加黄芩苷制剂可使奶牛增收2.71元/(头·d)。4结论本研究结果表明，饲粮添加10 g/(头·d)黄芩苷制剂可缓解夏季奶牛热应激，改善奶牛健康状况，促进奶牛采食，提高产奶量、乳脂率和乳蛋白率，降低乳体细胞数和隐性乳房炎发病率，提高了奶牛养殖效益。