木薯是全球三大薯类作物之一，可溶性糖类含量为75%~85%[1]。木薯主要应用于淀粉提取和乙醇发酵等行业，产生了大量废弃物——木薯渣。木薯渣主要由木薯表皮和植物细胞壁组成，含有大量纤维物质和少量的淀粉、脂肪和蛋白质等，是一种极具开发潜力的反刍动物饲料资源[2-3]。木薯渣年产量达数百万吨，直接掩埋或丢弃会造成环境污染和资源浪费。因此，利用非常规饲料木薯渣资源开发出新型绿色饲料资源逐渐成为研究热点。木薯渣纤维物质含量高，较难被动物直接利用吸收，适口性差，营养成分较单一，影响了木薯渣的营养和饲喂价值[4]。目前，微生物发酵可较有效地解决上述问题，是木薯渣利用的主要研究方向[5-6]。微生物可有效利用木薯渣中的纤维素、半纤维素和木质素等物质，在将木薯降解的同时产生蛋白，从而提高木薯渣的营养价值和适口性[7-8]。目前，关于发酵木薯渣使用的菌种及菌种搭配的研究有限。因此，本试验采用布氏乳杆菌、热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌及其两两组合制剂对木薯渣进行发酵处理，探究不同微生物对发酵木薯渣营养成分及体外消化率的影响，以期为发酵木薯渣在反刍动物中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料木薯渣原料购自青岛宇泰丰商贸有限公司，为乙醇发酵后废弃的木薯酒糟渣。木薯渣营养成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.023.T001表1木薯渣营养成分项目数值干物质/(g/kg FW)260.46±4.27粗蛋白/(g/kg DW)25.76±0.88中性洗涤纤维/(g/kg DW)242.58±7.65酸性洗涤纤维/(g/kg DW)198.35±2.46水溶性碳水化合物/(g/kg DW)28.95±1.86乳酸菌/(lgCFU/g FW)6.12±0.02好氧性细菌/(lgCFU/g FW)3.22±0.13酵母/(lgCFU/g FW)1.15±0.67布氏乳杆菌（Lactobasillus buchneri，LAB）、热带假丝酵母（Candida tropicalis，CT）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏号分别为CICC 20294（LAB）、CICC 32019（CT）和CICC 25064（BS）。将安瓿管冻干菌种按常规方法活化，培养，配制成不同菌种的菌液[9]，将不同菌液按1∶1体积比例两两组合。由于木薯渣中氮源和可溶性糖含量均较低，不利于微生物发酵，故本研究所有试验组和空白组中均添加1%尿素（占木薯渣干物质的质量百分比）和0.6%红糖（占木薯渣干物质的质量百分比）以补充氮源和可溶性糖[10]。尿素和红糖均为购自市场。聚乙烯单向呼吸阀薄膜袋（22 cm × 40 cm）购自本地商铺。1.2试验设计试验共设7个试验组，对照组（CK）添加蒸馏水，各试验组按木薯渣干重5%添加布氏乳杆菌（LAB）、热带假丝酵母（CT）、枯草芽孢杆菌（BS）、布氏乳杆菌+热带假丝酵母（G1）、布氏乳杆菌+枯草芽孢杆菌（G2）、热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌（G3）。将木薯渣与上述各组菌液、尿素和红糖混合，调整各组含水量约为65%，混匀，称取约1 kg样品，装入聚乙烯薄膜袋中并抽取空气至真空状态。每组设置3个重复，共计21袋。室温（22~29 ℃）避光贮藏，避光发酵15 d。1.3测定指标及方法1.3.1营养成分、发酵品质及感官评定将木薯渣在青贮前和开袋后，各组各取35 g样品，置于广口瓶中，添加150 mL超纯水稀释。将稀释后的样品置于4 ℃冰箱静置24~48 h，待分层稳定，使用3层纱布叠加过滤样品2~3次，分开保存滤液和木薯渣。滤液10 000×g离心15 min，吸取上清液分装于5 mL离心管，用于测定pH值和挥发性脂肪酸（VFA）。木薯渣置于65 ℃烘箱48 h，粉碎机粉碎，过40目筛，制成风干样，用于测定发酵木薯渣干物质营养成分[11]。使用便携式pH计（PHS-3E型）测定pH值。干物质、粗蛋白和粗脂肪采用常规方法测定[12-13]。采用尼龙袋法测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，利用全自动纤维分析仪（XF2800型）测定[14]。总钙含量参照GB/T 6436—2002标准，采用高锰酸钾法测定。乙酸、丙酸和丁酸等物质的含量使用气相色谱仪（Agilent-4890）测定。木薯渣的干物质回收率计算公式如下：干物质回收率=(开封后木薯渣质量×干物质比例)/(青贮前木薯渣质量×木薯渣原料干物质比例)×100%(1)从气味、色泽、质地对发酵木薯渣进行感官评定，评定标准参考《青贮饲料质量评定标准（试行）》进行，感官评定标准见表2，由经过培训或训练人员负责进行。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.023.T002表2感官评定标准项目评分标准分数气味气味有明显的苷酸香气，无酸臭味18~25微弱的淡酸味，芳香味弱9~17酸味较重或有刺鼻的酒酸味1~8有很强酸臭味或腐败味、霉烂味0~7色泽与原料相似，呈亮黄色14~20色泽稍有变色，黄色中带褐色8~13色泽变化较重，介于褐黄色和暗褐色之间1~7变色严重，呈暗褐色，或有较强的霉味0质地质地松软不粘手8~10微黏，不粘手4~7略带黏性1~3发黏并相互之间出现明显结块01.3.2发酵木薯渣体外消化率指标选择3头装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦公牛。于晨饲前1 h各取200 mL瘤胃液，现场混匀，经过纱布过滤至预温暖水瓶中（39 ℃）带回实验室，始终保持CO2通气。称取发酵后的木薯渣约0.5 g，放入预先称重的尼龙袋中（孔径为20 μm），放入培养注射器中平放。按1∶2体积比配制瘤胃液和人工唾液组成的消化液，取50 mL放入培养注射器中，保持无氧环境。准备42个培养注射器（7个处理×3个重复×2个批次），置于39 ℃水浴锅中振荡培养，分别于24和48 h停止发酵，各取21个样品，将取出的样品放入碎冰汇中冷却，终止发酵。取20 mL发酵液样品，使用便携式pH计测定体外发酵样品pH值（pH值），取出注射器中尼龙袋，使用冷水反复冲洗干净，置于烘箱中（65 ℃）烘干，冷却后称重记录，使用全自动纤维分析仪（XF2800型）测定中性洗涤纤维含量[14]。干物质降解率=(总干物质含量-消化后干物质含量)/总干物质含量×100%(2)中性洗涤纤维降解率=(总中性洗涤纤维含量-消化后中性洗涤纤维含量)/总中性洗涤纤维含量×100%(3)1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2016软件进行汇总和整理，SAS 9.2软件中的广义线性模型（GLM）进行单因素方差分析，Tukey's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1添加不同微生物对木薯渣营养成分的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，各试验组木薯渣发酵后的干物质回收率均显著降低（P0.05），G3组干物质回收率最低，比对照组降低了6.10%；G1~G3组的干物质回收率显著低于LAB组、CT组、BS组（P0.05）。与对照组相比，各试验组中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均显著降低（P0.05），其中G2组中性洗涤纤维含量最低，G3组酸性洗涤纤维含量最低。与对照组相比，各试验组木薯渣发酵粗蛋白含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.023.T003表3添加不同微生物对木薯渣营养成分的影响组别干物质回收率中性洗涤纤维酸性洗涤纤维粗蛋白钙CK组（对照组）99.23±0.18a26.33±0.46a19.64±0.15a2.85±0.08c0.35±0.01LAB组95.84±0.06b21.46±0.24b16.98±0.85b4.62±0.01b0.33±0.01CT组95.43±0.01b21.73±0.43b17.46±0.08b4.34±0.05b0.39±0.02BS组95.28±0.01b20.98±0.81b17.04±0.51b4.33±0.03b0.40±0.01G1组93.81±0.02c19.48±0.09b16.84±0.44c4.98±0.01ab0.38±0.02G2组93.42±0.01cd19.24±0.24b16.48±0.20c4.87±0.02ab0.34±0.01G3组93.18±0.06d19.83±0.22b16.24±0.03c5.16±0.01a0.36±0.02注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.2添加不同微生物对木薯渣发酵品质及感官评价的影响（见表4、表5）由表4可知，G1~G3组木薯渣发酵的pH值均低于LAB组、CT组、BS组，G3组木薯渣发酵pH值最低，显著低于其他各组（P0.05）。与对照组相比，G1~G3组木薯渣发酵的乙酸含量均显著高于LAB组、CT组、BS组（P0.05），且G3组产生乙酸含量最高。仅有G1~G3组检出丙酸，其中G3组丙酸含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.023.T004表4添加不同微生物对木薯渣发酵品质的影响组别pH值乳酸/(mmol/kg)乙酸/(mmol/kg)丙酸/(mmol/kg)丁酸/(mmol/kg)CK组（对照组）4.25±0.01a13.08±0.2812.05±0.85e—4.02±0.48LAB组3.62±0.01ab15.78±0.4618.99±0.08cd—4.66±0.26CT组3.56±0.01ab16.25±0.4818.62±0.25cd—4.89±0.20BS组3.59±0.02b14.55±0.0517.89±0.16d—4.28±0.19G1组3.12±0.02cd14.86±0.0823.53±0.89ab3.28±0.134.83±0.08G2组3.15±0.01c15.76±0.8420.08±0.52b3.39±0.154.67±0.16G3组3.11±0.01d16.89±0.4523.86±0.21a3.68±0.174.46±0.23注：“—”表示无此项指标数据。由表5可知，各添加组木薯渣发酵的得分均高于对照组，其中G3组得分最高（52分）；且复合微生物发酵各组总体比单一微生物发酵各组总体得分略高。发酵15 d，对照组的各项感官评分均最低，而且在开袋时伴有较刺鼻的酒酸味，色泽也偏褐色，结构松散但略带轻微黏性，发酵效果较差。而其他微生物添加组均具有较浓郁的甘酸香味，呈亮黄色，质地松散不粘手。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.023.T005表5添加不同微生物对木薯渣感官评价的影响组别气味色泽质地总得分CK组（对照组）610622LAB组2117846CT组2016844BS组2316847G1组2318849G2组2418951G3组2419952分2.3添加不同微生物对发酵木薯渣体外消化率的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，各处理组发酵木薯渣24 h中性洗涤纤维降解率均显著升高（P0.05）；G1~G3组发酵木薯渣的24 h干物质降解率均显著高于LAB组、CT组、BS组（P0.05），均以G3组最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.023.T006表6添加不同微生物对发酵木薯渣体外消化率的影响组别pH值24 h干物质降解率/%48 h干物质降解率/%24 h中性洗涤纤维降解率/%48 h中性洗涤纤维降解率/%CK（对照组）6.65±0.0262.34±0.25d70.94 ± 0.1230.36±0.09d43.26±0.25LAB6.68±0.0564.61±0.22c71.13 ± 0.0831.84±0.20bc44.69±0.43CT6.57±0.0363.99±0.17cd71.11 ± 0.2531.76±0.18bc44.94±0.32BS6.55±0.0164.26±0.38cd70.99 ± 0.2532.10±0.11b45.87 ± 0.11G16.25±0.0166.02±0.18b71.25 ± 0.1135.22±0.25a44.89 ± 0.24G26.55±0.0166.25±0.14ab71.46 ± 0.2634.94±0.18ab45.12 ± 0.31G36.58±0.0267.34±0.31a71.44 ± 0.2835.88±0.08a45.01 ± 0.123讨论3.1添加不同微生物对木薯渣营养成分的影响牧草饲料中蛋白质和纤维含量直接影响其营养价值和适口性[14]。木薯渣的蛋白质含量低（25.76 g/kg DM），纤维含量高，中性洗涤纤维含量为242.58 g/kg DM，酸性洗涤纤维含量为198.35 g/kg DM，导致营养价值偏低，适口性差。本研究表明，添加微生物对木薯发酵可以降低干物质回收率，降低底物中纤维含量，提高蛋白质水平，从而达到有效改善发酵木薯渣营养品质的作用。本试验中，与对照组相比，各试验组木薯渣发酵的粗蛋白含量显著提高，G3组粗蛋白含量约是对照组的1.8倍，与赵华等[15]关于复合微生物固态发酵可以显著提高木薯渣营养价值的结论一致。本研究发现，添加复合菌种能够比添加单一菌种更好地改善发酵品质，与徐高骁等[8]和Kaewpila等[16]研究结果一致。黄金华等[17]研究了三种微生物（黑曲霉、酿酒酵母、米曲霉）和一种益生菌制剂的不同组合对木薯渣发酵营养品质的影响，发现将上述四种菌及制剂混合可达到最好的发酵效果，其粗蛋白含量显著高于其他组合，pH值最低。本研究表明，热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌组合发酵木薯渣的效果最好。有研究表明，热带假丝酵母在发酵过程中可产生大量酵母菌，其菌体有利于提高发酵饲料的粗蛋白含量[18]。枯草芽孢杆菌在生长过程中能够产生并分泌许多种酶（纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等），可以很好地与其他微生物协同发酵[19]。由于木薯渣含氮量和可溶性糖量均较低，而保证一定浓度的可溶性糖类和充足的氮源对微生物发酵，并产生优质发酵饲料至关重要[20-21]。添加外源性氮源（如尿素），通过微生物代谢途径可转化为生物蛋白（菌体），从而显著提高发酵木薯渣蛋白质含量。因此，本研究中各组均添加了1%尿素和0.6%红糖以补充氮源和可溶性糖，促进了木薯渣发酵品质的提高。3.2添加不同微生物对木薯渣发酵品质及感官评价的影响pH值是衡量饲草或饲料发酵品质的重要指标之一。一般认为优质发酵饲料的pH值应低于4.2[22-23]，因为较低的pH值可在整个发酵过程中抑制其他有害微生物的繁殖，能够在发酵起始阶段快速降低环境pH值，更早抑制杂菌对蛋白质、糖类等营养物质的消化，尽可能减少营养损失，从而达到提高发酵饲料品质的目的[24]。本试验显示，除对照组外，各处理组木薯渣发酵的pH值均低于4.2，达到了优质水准，而且添加复合微生物的处理组的pH值显著高于添加单一微生物组。上述结果表明，在木薯渣发酵过程中添加微生物可以有效提高其发酵品质，而且添加复合微生物可以更好地提高木薯渣发酵品质，与白秀梅等[10]和彭开屏等[11]的结论一致。未添加任何微生物进行木薯渣发酵，品质不佳的原因可能是试验中木薯渣为酒糟木薯渣，可能包含非常多的杂菌或有害菌，影响木薯渣的发酵品质。另一个衡量发酵饲料品质的指标是挥发性脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸等），乙酸和丙酸含量高有利于降低发酵底物pH值，提高有氧稳定性，防止发酵饲料变质[25]，但丁酸含量高往往被认为是发酵饲料质量差的表现[23]。本研究中，G3组木薯渣发酵的乙酸和丙酸含量最高，可能是G3的菌种组合在发酵过程中分泌了较多水解酶，导致最终产生较多的挥发性脂肪酸。本试验中各添加组丁酸含量普遍高于对照组，但含量不高且差异不显著，而且不影响整体品质，与马静静等[26]的结论不一致，可能是由于添加菌种和使用的木薯渣来源均不同。本试验中，各添加组感官评价得分均高于对照组，发酵后总体感官评价也较高，而添加复合微生物的处理组比添加单一微生物的组得分要高，得分最高的为G3组。3.3添加不同微生物对发酵木薯渣体外发酵的影响饲料中干物质和中性洗涤纤维的含量不仅影响饲料适口性，还会影响饲料在反刍动物胃肠道的消化率[27]。瘤胃液的pH值是衡量动物身体是否健康和瘤胃内环境是否正常的重要指标之一[28]。本研究结果显示，各组瘤胃液pH值为6.25~6.68，均在正常范围内（5.5~7.0）[29]。本研究中，与对照组相比，各试验组24 h干物质降解率和24 h中性洗涤纤维降解率均显著升高；复合微生物组24 h干物质降解率和24 h中性洗涤纤维降解率均高于单一微生物组，均以G3组最高。结果表明，添加不同微生物发酵木薯渣饲料在瘤胃消化初期的降解率存在较明显的差异，但进入瘤胃消化后期则影响不大。干物质降解率可反映瘤胃对饲料中的蛋白质、纤维素等营养物质的利用效率[30]。由于木薯渣营养价值较低，不能作为主要原料添加到饲料中，但其价格较低，经过适当的微生物发酵提高其营养价值后可部分替代价格高昂的原料（如玉米和象草等）以达到降低饲喂成本的目的。有研究利用发酵木薯渣替代一定比例的粗饲料饲喂水牛，结果显示，使用发酵木薯渣替代部分象草或玉米秸秆对牛瘤胃体外发酵特征无明显影响，还可节约饲喂成本，合适的替代比例分别为象草25%、玉米秸秆25%~50%[31-32]。郑宇慧等[33]研究发现，添加30%木薯渣对奶牛瘤胃挥发性脂肪酸产生具有明显的抑制作用。因此，根据本试验结果可进一步研究G3组发酵木薯渣替代粗饲料的添加量。4结论本研究结果表明，在木薯渣中添加布氏乳杆菌、热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌或其组合菌制剂均能够不同程度地改善发酵木薯渣的营养价值、发酵品质和体外降解率，且发酵过程中添加复合微生物比添加单一微生物效果更好。本研究条件下，适宜的微生物组合为热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌。