紫花苜蓿营养丰富，是优质的牧草资源[1-3]。天水市苜蓿种植面积达40 000公顷以上，每年可生产苜蓿干草超过24万t。苜蓿草加工利用以调制干草为主，干草加工依靠田间或晾晒场自然晾晒干燥，耗时较长，受雨热环境等气候因素影响较大[3-4]，翻动晾晒期间落叶、雨淋等造成营养物质损失严重[3-4]。尤其是川区第三茬、山区第二茬苜蓿收割正值雨季，大量收割后的紫花苜蓿鲜草遇到多雨天气，干草调制损失严重，青干草色泽及营养品质较差，大量苜蓿草未能得到充分利用，影响了草业经济的可持续发展，成为长期制约苜蓿干草加工的问题。苜蓿青贮可有效解决上述问题。青贮是在厌氧环境下，利用乳酸菌发酵可溶性碳水化合物（WSC）转化成乳酸（LA）等有机酸。随着LA累积，青贮料pH值下降，各种有害微生物活动受到抑制，乳酸菌也停止生长繁殖，从而达到长期保存苜蓿青贮料的目的。但苜蓿原料的蛋白质含量高、WSC含量低、缓冲能值高、附着乳酸菌含量少，直接青贮难度大[1]。本试验结合苜蓿自身特性，添加乳酸菌、纤维素酶、玉米面粉等添加剂对苜蓿进行青贮，提高苜蓿青贮品质、保存更多营养物质，缓解苜蓿难以青贮的问题，为苜蓿青贮饲料的生产应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验于2020年在甘肃省天水市清水县黄门镇开展，以当地种植的三年生紫花苜蓿为原料。初花期刈割铡碎，晾晒至水分含量约64.8%进行青贮。乳酸菌剂（植物乳杆菌活菌数≥1.6×1010 CFU/g，布氏乳杆菌活菌数≥4.0×109 CFU/g），由四川高福记生物科技有限公司提供。纤维素酶（固体）酶活5万U/g，由浙江一诺生物科技有限公司提供。玉米面粉为天水市清水县本地种植玉米生产的面粉。1.2试验设计采用单因素试验设计，共设7组，无添加青贮为对照组（CK组），试验组分别添加5 g/t乳酸菌（LA组）、1 000 g/t纤维素酶（CE组）、5 g/t乳酸菌+500 g/t纤维素酶（LA+CE组）、5 g/t乳酸菌+23 kg/t玉米面粉（LA+CF1组）、23 kg/t玉米面粉（CF1组）、28 kg/t玉米面粉（CF2组）进行青贮，每组设3个重复，青贮包重约60 kg/包。1.3测定指标及方法1.3.1样本处理试验采用裹包青贮，紫花苜蓿在初花期收割切碎成3~5 cm长，露天晾晒场晾晒5~6 h，微波炉测定含水量64.8%时开始青贮。青贮时将玉米面粉按量直接洒在草料上搅拌均匀，纤维素酶、乳酸菌剂使用一定量清水溶解，静置活化1~2 h，进行稀释，均匀地喷洒在草料上，草料均打捆包膜，一次性完成裹包青贮。1.3.2感官评价青贮试验贮藏70 d，对每个处理的苜蓿青贮饲料取样，根据农业农村部《青贮饲料质量评定标准》，从颜色、气味、质地3个方面进行现场感官评定。1.3.3营养品质每个处理取1 000 ｇ样品装入真空塑料袋做好标记，进行发酵品质和营养品质相关指标测定。采用pH值测定仪测定青贮料浸出液pH值，液相色谱法测定LA、乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）含量，苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮（NH３-N）含量[3]。采用烘箱烘干法测定样品干物质（DM）含量[1,3]，Van Soest法测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量[1,3]，凯氏定氮法测定粗蛋白（CP）含量[1,3]，葸酮-硫酸比色法测定WSC含量[3]，灰化法测定粗灰分（Ash）含量，采用索氏浸提法测定粗脂肪含量。1.4数据统计与分析试验结果采用Microsoft Excel软件进行整理，SPSS软件进行方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同添加处理对苜蓿青贮饲料感官评价的影响青贮70 d对苜蓿青贮饲料进行现场感观评定，结果显示，LA组、LA+CE组、CF2组苜蓿青贮有柔和的酸香气味，LA+CF1组苜蓿青贮有浓郁的酸香气味，CF1组苜蓿青贮有呛鼻的酸味和氨气味，CE组苜蓿青贮略有呛鼻的酸臭味和氨气味，CE、CK组苜蓿青贮略有呛鼻的酸臭味和氨气味。LA组、LA+CE组、CF2组、CF1组苜蓿青贮色泽为黄绿色，LA+CF1组苜蓿青贮为亮黄绿色，CE组苜蓿青贮茎叶发黄发暗，CK组苜蓿青贮为黄褐色。LA组、LA+CE组、LA+CF1组、CF2组、CF1组茎叶结构均完整、松散柔软、无黏性、无霉斑，CE组和CK组苜蓿青贮茎叶结构完整，略有黏性。2.2不同添加处理对苜蓿青贮饲料发酵品质的影响（见表1）由表1可知，与CK组相比，各添加组苜蓿青贮的pH值均显著降低（P0.05）；LA+CE组、LA+CF1组、CF2组、LA组苜蓿青贮LA含量显著升高（P0.05）；LA+CF1组、CE组、LA组苜蓿青贮AA含量均显著升高（P0.05），CF2组、LA+CE组、CF1组AA含量显著降低（P0.05）；LA+CF1组、LA+CE组、CE组、LA组、CF2组PA含量显著降低（P0.05）；LA+CF1组、LA+CE组、LA组苜蓿青贮BA含量均显著降低（P0.05）；LA+CF1组、LA+CE组、CF2组、LA组苜蓿青贮NH3-N/TN均显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.024.T001表1不同添加处理对苜蓿青贮饲料发酵品质的影响组别pH值LA/％AA/％PA/％BA/％NH3-N/TN/％CK组4.890±0.023a37.44±0.35de32.82±0.48b27.78±0.50b1.79±0.14a28.27±0.39aLA组4.610±0.018c39.64±0.25c35.05±0.29a22.42±0.35d1.52±0.04bc23.02±0.33bCE组4.750±0.018b38.25±0.53d35.19±0.57a21.63±0.46d1.77±0.03a28.45±0.22aLA+CE组4.590±0.019c48.62±0.46a31.23±0.33c18.51±0.43e1.43±0.07cd22.14±0.26bcLA+CF1组4.560±0.024c42.59±0.34b36.20±0.43a19.26±0.39e1.30±0.05d21.31±0.24cCF1组4.810±0.023b36.71±0.43e25.59±0.51d35.55±0.47a1.71±0.09a28.32±0.35aCF2组4.750±0.033b41.79±0.44b31.24±0.40c25.07±0.36c1.68±0.05ab22.39±0.35b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3不同添加处理对苜蓿青贮饲料营养品质的影响（见表2）由表2可知，与CK组相比，LA+CF1组、LA组苜蓿青贮DM含量显著升高（P0.05）；LA+CF1组、CF2组、LA+CE组苜蓿青贮CP含量显著升高（P0.05）；LA+CF1组、CF2组、CF1组、LA+CE组、LA组苜蓿青贮WSC含量显著升高（P0.05）；各处理组苜蓿青贮EE含量均显著升高（P0.05）；CF2组、LA+CF1组、LA+CE组、CE组苜蓿青贮Ash含量显著降低（P0.05）；LA+CF1组、LA+CE组、CE组、LA组、CF2组苜蓿青贮NDF含量显著降低（P0.05）；LA+CE组、CE组、LA+CF1组苜蓿青贮ADF含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.024.T002表2不同添加处理对苜蓿青贮饲料营养品质的影响组别DM/％CP/％DMNDF/％DMADF/％DMWSC/％DMEE/％DMAsh/％DMCK组32.30±0.53c18.05±0.16c41.52±0.36a31.94±0.19a1.26±0.04d2.89±0.03d11.17±0.33aLA组33.52±0.33b18.80±0.19abc40.06±0.18bc31.54±0.25ab1.60±0.08c3.04±0.05c10.48±0.28abCE组32.15±0.18c18.09±0.23bc39.82±0.23bcd29.65±0.24c1.39±0.06d3.12±0.02c9.91±0.22bcLA+CE组32.87±0.27bc18.85±0.27ab39.29±0.39cd29.21±0.22c1.85±0.09b3.25±0.06a9.90±0.33bcLA+CF1组36.32±0.31a19.13±0.26a39.09±0.36d30.96±0.20b2.29±0.04a3.18±0.02ab9.74±0.25bcCF1组31.10±0.32d18.09±0.27bc41.54±0.27a31.73±0.26a1.93±0.07b3.06±0.03c10.60±0.23abCF2组33.25±0.35bc18.89±0.27a40.32±0.21c31.23±0.16ab2.18±0.06a3.12±0.04bc9.10±0.19c3讨论3.1不同添加处理对苜蓿青贮饲料感官评价的影响本研究中，LA组、LA+CE组、CF2组苜蓿青贮具有柔和的酸香气味，色泽为黄绿色，烘干后比较接近原料色；LA+CF1组苜蓿青贮饲料具有浓郁的酸香气味，色泽为亮黄绿色；CF1和CE组苜蓿青贮具有呛鼻的酸味和氨气味，CF1组色泽为黄绿色，茎叶结构完整、松散柔软、无霉斑；CE组茎叶发黄发暗、结构完整；CK组苜蓿青贮饲料略有呛鼻的酸臭味和氨气味，颜色为黄褐色，叶子结构基本完整。本研究结果表明，LA组、LA+CE组、CF2组苜蓿青贮感官评价优于CK组，CF1、CE组在感官上与CK组相比无明显优势。3.2不同添加处理对苜蓿青贮发酵、营养品质的影响根据微生物的活动，苜蓿青贮发酵过程分为有氧呼吸阶段、厌氧发酵阶段、发酵稳定阶段、有氧腐败阶段[5-6]。有氧呼吸阶段中植物呼吸作用和酶解变化、好氧微生物活动消耗有机物，分解蛋白质、WSC，青贮料营养成分损失。经过有氧呼吸阶段，密闭环境中氧气耗尽形成厌氧环境，乳酸菌迅速繁殖，发酵产生大量LA，pH值开始下降，直到乳酸菌发酵占主导，腐败微生物生长受限、厌氧性梭菌停止活动；pH值降到一定程度时，乳酸菌及所有微生物活动全部停止，进入稳定状态[5-6]。有氧腐败阶段发生在青贮饲料的取用阶段，由于接触空气，好氧性有害微生物活动使饲料品质降低[5-6]。若青贮过程中pH值较高、LA形成不足、糖分过少，无法抑制有害微生物活动，蛋白质、氨基酸分解产生NH3-N，丁酸梭菌等作用将碳水化合物和LA分解产生BA，营养物质损失，BA累积导致青贮饲料发臭。苜蓿青贮饲料中NH3-N、pH值及LA、BA含量是评价其发酵品质的重要指标[2-3,7-8]。营养价值评定指标主要有DM、CP、EE、ADF、NDF、Ash等[6-7,9]。DM含量直接反映底物营养成分的浓度[6]。WSC是日粮中能量的主要来源。EE是能源物质，也是评价饲料适口性的重要指标[6]。NDF和ADF是衡量反刍动物干物质采食量、瘤胃发酵内环境及消化率最重要的指标[6-7]，ADF含量越低，饲草消化率越高，饲用价值越大。LA含量越高，BA含量越低，表明青贮时乳酸菌发酵占优势，青贮品质越好[2-3,10]。王亚芳等[10]、穆胜龙等[11]研究表明，NH3-N能够反映蛋白质和氨基酸分解的程度，其含量越高，蛋白质分解越多，青贮品质越差。本试验中，LA+CF1组、LA+CE组、LA组、CF2组苜蓿青贮的pH值、NH3-N/TN及BA、PA含量均显著低于CK组，LA含量均显著高于CK组，LA组AA含量显著高于CK组。本研究表明，LA+CF1组、LA+CE组、LA组、CF2组初期饲料中乳酸菌大量繁殖，LA大量累积，pH值迅速下降，抑制了有害菌生成和植物酶活性，糖的氧化和蛋白质水解减少，营养损失降低，NH3-N和BA生成减少，饲料适口性改善、消化率提升，青贮饲料的发酵和营养品质均得到改善。穆胜龙等[11]研究发现，异型发酵乳酸菌发酵后可提高AA含量，进而提高青贮饲料的有氧稳定性。薛春胜等[12]研究表明，添加乳酸菌、乳酸菌+糖蜜青贮均可提高苜蓿青贮饲料的有氧稳定性。王木川等[13]研究表明，添加乳酸菌可在一定程度上改善苜蓿青贮的发酵品质和营养成分。王亚楠等[14]指出，添加一定量的糖可获得优质苜蓿青贮饲料。卢强等[15]研究发现，添加糖类可为乳酸提供足够底物，促进乳酸菌大量增殖，玉米粉属于糖类添加剂。本试验中，CF2组添加玉米粉的量弥补了青贮原料本身糖分不足，为乳酸菌发酵提供足够底物，促进乳酸菌活动，LA增多，pH值迅速降低，抑制蛋白质降解，青贮品质得到改善。王永新等[16]研究表明，玉米粉等添加剂显著影响苜蓿青贮品质和营养成分，可改善淋雨苜蓿青贮，与本研究结果一致。本试验中，LA+CF1组混合添加乳酸菌和玉米粉可补充饲料本身乳酸菌和WSC不足，青贮饲料pH值、NH3-N/TN及BA、NDF含量及最低，CP含量最高，AA、DM、WSC含量均显著高于LA+CE组，青贮品质得到改善。刘金兰等[17]研究表明，适宜浓度的乳酸菌剂和蔗糖混合液可显著提高苜蓿青贮饲料的品质，与本试验结论一致。本试验中，LA+CE组混合添加乳酸菌和纤维素酶以补充乳酸菌不足，纤维素酶将多糖降解为可被乳酸菌发酵利用的单糖，达到改善青贮品质的目的。LA+CE组LA含量显著高于LA组，pH值、NH3-N/TN以及BA含量相对较低，对青贮饲料品质的改善效果优于LA组，与魏晓斌等[9]得出乳酸菌和纤维素酶混合添加效果优于二者单独使用的研究结果一致。刁其玉等[18]研究表明，纤维素酶降解植物细胞壁增加WSC含量，在添加乳酸菌剂的基础上辅以纤维素酶可促进乳酸菌发酵，且同时添加乳酸菌和纤维素酶比单独添加乳酸菌接种剂效果好。本试验中，与CK组比，CF1、CE组pH值显著降低，LA、BA、CP、DM含量及NH3-N/TN差异不显著，表明试验CE组苜蓿青贮饲料的可消化成分和适口性得到有效提高，但CF1、CE组饲料品质未得到明显改善，添加剂未能有效发挥作用。王永新等[16]研究表明，添加玉米粉利于改善青贮发酵条件，该结果与本研究不同，可能是因为CF1组中玉米粉的添加量不够，乳酸菌发酵底物不足，产生LA数量较少，未能形成有效的酸性环境抑制有害菌繁殖，且CP水解产生相对较多的NH3-N。本试验中，CE组饲料品质未得到显著改善，与王木川等[13]、夏明等[19]研究结果基本一致。但薛艳林等[20]研究表明，添加纤维素酶可将植物性多糖降解为单糖，为乳酸菌发酵提供底物，促进青贮发酵，显著提高青贮饲料的发酵品质，与本研究不同。原因可能是纤维素酶最适作用温度、水分、pH值无法满足，纤维素酶未能发挥应有效果，也可能受酶的来源、活性及青贮原料的影响[19]。本试验中，CE组NDF、ADF含量显著低于CK和CF1组，与王亚芳等[10]研究结果相同，表明添加纤维素酶可提高青贮饲料消化率。4结论LA组、LA+CE组、LA+CF1组、CF2组苜蓿青贮发酵和营养品质均得到改善，且LA+CF1组饲料品质最好，其次是LA+CE组。LA+CF1和LA组苜蓿青贮的有氧稳定性有所提高，可防止二次发酵。