桑椹又名桑葚子，椭圆形，长1~3 cm，表面不平滑[1-2]。桑椹在我国分布广泛，主要分布南方各省，其中浙江、江苏、福建为主要分布区，因具有较高药用价值而备受关注[3-4]。桑椹富含多糖、维生素A原、氨基酸、苹果酸、琥珀酸等营养成分，具有较高的药用价值[5-9]。桑椹多糖能够促进畜禽生长和乳腺发育，提高动物繁殖力和泌乳性能，增强机体免疫力[10-13]，因此被广泛应用于家禽牲畜饲料。我国禁止在饲料中添加抗生素，亟须寻找一种毒性小、疗效强、兼药物性和营养性于一体的中草药添加剂作为畜禽抗生素替代品[14-18]。桑椹多糖作为一种新型饲料添加剂具有较好的开发价值和广阔的应用前景。目前，桑椹多糖作为饲料添加剂运用于饲料中鲜见报道。本试验采用超声辅助法提取桑椹中的多糖，研究其体外抗氧化活性，以期为桑椹多糖工业化生产及其在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料桑椹为市售，选取无霉变、无腐烂、无机械损伤的鲜果室内晾干，粉碎，过80目筛，置于洁净的容器中保存。试验用水符合GB/T 6682—2008中三级水的规定，由黄河水利职业技术学院制备。正丁醇、浓硫酸、硫酸亚铁、无水乙醇、苯酚、三氯甲烷均为分析纯，购自广东滃江鸿运有限公司；D-无水葡萄糖购自坛墨质检科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、维生素C购自北京坛墨质检有限公司。1.2试验仪器UV23Ⅱ紫外可见分光光度计（天美仪拓实验室设备有限公司）、CLN-24L低温组织研磨仪（天津盛宏仪器科技有限公司）、AP135W岛津分析天平（SHIMADZU公司）、H2500R-2高速冷冻离心机（湖北鼎泰高科有限公司）、LabTower EDI超纯水仪（北京鸿运科技实验室产品有限公司）、TUBE-50mL塑料离心管（北京天赐实验仪器有限公司）、WTY-20干燥箱（天津中伟有限公司）、QWE-2022水浴锅（广东宏宇实验器材有限公司）、80目筛（河北省安平县康威金属丝网制品有限公司）、尖底塑料带盖离心管（南通顺丰医疗器械有限公司）、ErgoOne移液器（乾芸仪器科技有限公司）。1.3测定指标及方法1.3.1桑椹粗多糖称取适量桑椹粉末样品置于50 mL具塞离心管，加入20 mL无水乙醇混匀，超声波辅助提取仪中提取120 min，每隔10 min取出摇匀，提取结束，5 500 r/min离心20 min，弃去上清液。不溶物使用80%乙醇溶液10 mL进行洗涤，离心，将沉淀物干燥，去除色素、脂肪等杂质的桑椹粉末为试验样品。称取桑椹粉末试验样品2.0 mg（精确至0.000 1 g）置于100 mL锥形瓶，按照液料比为20 mL/g加入40 mL水，过夜，于超声波辅助提取仪提取，提取温度55 ℃、超声功率180 W、提取时间30 min、仪器工作频率40 kHz，提取结束，冷却至室温，过滤，将上清液转移至旋转蒸馏浓缩瓶中。残渣再重复提取1次，合并提取液后浓缩至2~3 mL，过C18固相萃取小柱后收集净化液及洗脱液于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得桑椹样品溶液。吸取桑椹样品溶液2 mL置于10 mL离心管中，4倍体积加入无水乙醇于4~8 ℃冷藏冰箱中过夜，沉淀，5 000 r/min离心15 min，弃去上清液，沉淀以80%乙醇洗涤2~3次，烘干，使用蒸馏水复溶并定容至50 mL，即得桑椹多糖测定液。1.3.2多糖的测定采用苯酚-硫酸法[19-20]，以葡萄糖为对照品，依据SN/T 4260—2015制作标准曲线。准确称取0.100 g葡萄糖于1 000 mL容量瓶中，加蒸馏水定容刻度，超声溶解，即得浓度为0.1 g/L贮备液，4 ℃冰箱保存。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL贮备液于20 mL具塞试管，使用蒸馏水补至1.0 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，混匀，加入5 mL硫酸，静止10 min，使用旋涡振荡混匀，试管30 ℃水浴锅中反应20 min，冷却，于490 nm测定吸光度。以吸光度、浓度分别为纵坐标（Y）与横坐标（X），得线性回归方程：y=25.354 5x-0.021 4，R2=0.999 8。准确吸取1.0 mL桑椹多糖测定液，按照标准工作曲线溶液进行显色反应，于490 nm测定吸光度，计算桑椹多糖得率。桑椹多糖得率=c×n×VW×106×100% (1)式中：c为多糖浓度（mg/L）；V为提取液体积（mL）；n为稀释倍数；W为样品干重（g）。1.3.3单因素试验按照1.3.1方法提取桑椹多糖，提取条件为：固定液料比20 mL/g、功率180 W、时间30 min，考察不同提取温度（35、45、55、65、75 ℃）对桑椹多糖得率的影响；固定提取温度55 ℃，提取功率为180 W、提取时间为30 min，考察不同液料比（10、15、20、25、30 mL/g）对桑椹多糖得率的影响；固定提取温度55 ℃、液料比20 mL/g、提取时间30 min，考察不同提取功率（120、140、160、180、200 W）对桑椹多糖得率的影响；固定提取温度55 ℃、液料比20 mL/g、提取功率180 W，考察不同提取时间（10、20、30、40、50 min）对桑椹多糖得率的影响。1.3.4响应面因素水平设计（见表1）选取单因素为自变量，以桑椹多糖得率为（Y）为响应值，做4因素3水平响应面设计，对多糖的提取工艺条件进行优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.T001表1响应面因素水平设计水平A/℃B/(mL/g)C/WD/min-1451516020055201803016525200401.3.5桑椹多糖的纯化将桑椹多糖粗体液浓缩至原体积的10%，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇，置于冷藏冰箱中并将其温度调至5℃沉淀24 h，将其转移至离心管中进行离心，弃去上清液后收集沉淀，使用无水乙醇、丙酮、乙醚依次分别进行洗涤。将洗涤后的沉淀烘干使用水复溶，采用Sevag法去除蛋白[向多糖溶液中加入其体积三分之一的Sevage溶液（V正丁醇∶V氯仿=1∶5）萃取多次除去蛋白质，直至两相间无乳白色絮状物为止，以50 mL/g比例加入活性炭，60 ℃脱色5 h，离心去除活性炭。将除去蛋白、脱色的多糖溶液旋转蒸馏浓缩，去除Sevage溶液，醇沉60 ℃烘干，得桑椹多糖。1.3.6桑椹多糖体外抗氧化活性准确称取纯化后的桑椹多糖0.1 g于10 mL容量瓶中，加水超声溶解，定容至刻度，得浓度为10 g/L桑椹多糖中间溶液，梯度稀释法配制成0.05、0.10、0.20、0.40、0.80和1.00 g/L的桑椹多糖溶液。1.3.6.1桑椹多糖对DPPH·的清除能力参考文献[21]，分别取6支10 mL离心管，并向其加入0.05、0.10、0.20、0.40、0.80和1.00 g/L不同浓度的桑椹多糖溶液，再加入0.2 mmol/L的DPPH溶液4 mL，摇匀，取牛皮纸将试管严实包裹避光反应30 min，反应完毕后于分光光度计在517 nm进行测定。计算DPPH·清除率。DPPH·清除率=A0-Ai-AjA0×100% (2)式中：A0为1 mL蒸馏水+4 mL的DPPH溶液的吸光度；Ai为1 mL样品+4 mL的DPPH溶液的吸光度；Aj为1 mL样品+4 mL的无水乙醇的吸光度。1.3.6.2桑椹多糖对OH·清除能力参考文献[22]，分别取6支10mL离心管，并向其加入0.05、0.10、0.20、0.40、0.80和1.00 g/L不同浓度的桑椹多糖溶液，依次分别向6支离心管中加入水杨酸和FeSO4。其中水杨酸浓度为6 mmol/L，加入体积为2.0 mL；FeSO4浓度为6 mmol/L，加入体积为2.0 mL。充分混匀，分别向6支离心管中加入6 mmol/L的双氧水启动Fetion反应，置于35~40 ℃恒温水浴35 min，静置15 min，于分光光度计在517 nm进行测定。计算OH·清除率。OH·清除率=Ae-Ax-AsAe×100%(3)式中：Ae为空白组吸光度；Ax为样品组吸光度；As为去离子水代替H2O2测得对照组的吸光度。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1提取温度对多糖得率的影响（见图1）由图1可知，所选提取温度整体范围为35~75 ℃，当浸提温度在所选温度35~55 ℃围内随着温度的逐渐升高多糖提取得率逐渐增大；当浸提温度在55 ℃时多糖提取得率在所考察的温度范围内达到最大值；当提取温度为55 ℃后继续升温，多糖提取得率反而有所降低。原因是在低温时逐渐升温有助于降低样品与提取溶剂的黏稠度，增加了样品提取物在提取溶剂中溶解度，有利于样品提取物溶入提取溶剂中，从而增加样品提取物的提取得率。当提取温度大于最优提取温度55 ℃时，继续升高提取温度会导致样品提取物多糖被高温破坏，故提取温度达到最优提取温度后继续升温样品提取物多糖得率有所降低。因此，选择最优提取温度附近的45、55、65 ℃进行响应面优化试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F001图1提取温度对多糖得率的影响2.1.2液料比对多糖得率的影响（见图2）由图2可知，所考察液料比整体范围为10~30 mL/g。液料比在10~20 mL/g之间，随着液料比增加样品提取物多糖得率急剧升高。当液料比大于20 mL/g，样品提取物多糖得率趋于平缓增长。原因是液料比在低范围内时继续增加液料比有助于增大桑椹样品与提取溶剂的接触面积，有利于样品提取物多糖溶入提取溶剂中，从而使样品提取物多糖的提取得率急剧增加；当液料比增加到一定程度后继续增大液料比会使样品提取物多糖提取得率趋于平缓增长，其原因是样品提取物多糖已大部分溶入提取溶剂中，继续增加液料比还会造成其他杂质溶出，故多糖提取得率增长趋于平缓。因此，选择液料比为15、20、25 mL/g进行响应面优化试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F002图2液料比对多糖得率的影响2.1.3提取功率对多糖得率的影响（见图3）由图3可知，所考察提取功率整体范围为120~200 W。当提取功率在120~180 W之间时，随着提取功率的增加样品提取物多糖得率逐渐升高；当桑葚多糖提取率达到最大值时的提取功率为180 W；继续增加提取功率会导致样品提取物多糖得率有所降低。原因是在适宜的提取功率中会产生更好的空化效果使桑葚样品细胞壁更容易被破坏，从而有利于提取物多糖溶出；当浸提功率达到最优水平后继续增加提取功率有可能破坏桑椹多糖的结构，从而使其多糖提取得率有所降低。因此，选择提取功率160、180、200 W进行响应面优化试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F003图3提取功率对多糖得率的影响2.1.4提取时间对多糖得率的影响（见图4）由图4可知，所考察提取时间整体范围为10~50 min。当浸提时间在10~30 min时，随着提取时间延长样品提取物多糖得率逐渐升高；当提取时间为30 min时，样品提取物多糖得率达到最大值；当提取时间达到最优水平后继续延长浸提时间，样品提取物多糖得率反而有所降低。因此，选择提取时间20、30、40 min进行响应面优化试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F004图4提取时间对多糖得率的影响2.2响应面法试验优化结果2.2.1响应面试验结果（见表2）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.T002表2响应面优化试验结果试验号ABCD多糖得率/%11-1008.522011-15.93300-117.254-10006.18501006.57610108.4870-1-114.218000-16.99900005.4510-11114.87110-1-107.751210008.1913000-14.8714-11012.4515000010.541600-107.46171-1006.4518001-17.9919-10008.812000-117.45211-1005.172200004.6623001-19.4324-11007.842500-118.952600005.78271-11-17.652800004.9429-11003.26根据Box-Behnken试验原理[23]，以单因素为自变量，以桑椹多糖得率（Y）为响应值，对数据进行回归拟合，得到回归方程为：Y=45.95+0.46A-0.26B-0.34C+0.64D+0.41AB-0.31AC+0.44AD+0.55BC-0.71BD+0.26CD-0.87A2+1.21B2-0.86C2+1.07D2。2.2.2方差分析结果（见表3）由表3可知，P模型0.000 1，表明回归模型具有高度显著性；P失拟项=0.7860.05，表明模型构建成功；通过判定系数（R2=0.996 5）可评价回归模型的拟合程度。根据F值可知，单因素对多糖得率影响的主要次序：浸提功率（C）浸提温度（A）浸提时间（D）＞料液比（B）。其中A、C、BC、BD、D2对多糖得率的影响极显著（P0.01）；D、A2、AB、AC对多糖得率的影响显著（P0.05），其余项对指标影响不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.T003表3回归模型的方差分析项目平方和自由度均方F值P值模型56.780 0143.690 017.6500.000 1**A13.450 0113.450 064.0470.000 3**B0.082 010.082 00.3900.670 0C13.150 0113.150 062.6190.000 1**D1.191 011.191 05.6710.042 4*AB1.735 611.735 68.2650.024 0*AC1.306 211.306 26.2200.034 0*AD0.550 010.550 02.6190.168 0BC4.206 314.206 320.0300.001 3**BD3.824 113.824 118.2100.004 0**CD0.066 010.066 00.3140.655 0A21.493 111.493 17.1100.026 0*B20.065 110.065 10.3100.541 0C20.382 210.382 21.8200.214 0D212.540 0112.540 059.7140.000 1**残差5.460 0140.210 0失拟项3.690 0100.380 00.786纯误差2.130 040.320 0总差59.870 028注：1.“*”表示影响显著（P0.05），“**”表示影响极显著（P0.01）。2.R2=0.996 5。2.2.3各因素交互作用对多糖得率的影响（见图5）由图5可知，提取功率与提取温度对多糖的得率影响较大，提取时间、液料比次之，与表3的分析结果一致；提取温度和液料比、提取温度和提取功率的响应曲面走势陡峭，表明两者交互作用显著。图5各因素交互作用对桑椹多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F5a1（a）提取温度与液料比对桑椹多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F5a2（b）提取温度与提取功率对桑椹多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F5a3（c）提取温度与提取时间对桑椹多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F5a4（d）液料比与提取功率对桑椹多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F5a5（e）液料比与提取时间对桑椹多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F5a6（f）提取功率与提取时间对桑椹多糖得率的影响2.2.4验证试验应用响应面优化各因素可得桑椹多糖提取最优工艺参数：提取温度55.54 ℃、液料比19.89 mL/g、提取功率181.12 W、提取时间30.15 min，预测提取得率为10.98%。将其修正为：提取温度55 ℃、液料比为20 mL/g、提取功率为180 W、提取时间为30 min。在该条件下进行验证，实际提取得率为10.54%，该值与预测值10.98%基本相符，表明该最优工艺参数可行。2.3抗氧化活性的分析2.3.1桑椹多糖粗提物对DPPH·清除能力（见图6）由图6可知，DPPH·在517 nm处具有较强的吸光度，当桑椹多糖浓度在0.05~1.00 g/L范围内时，对DPPH·的清除率随着样品浓度的增加而呈上升趋势，表现出良好量效关系，当VC质量浓度在0.2 g/L时，对DPPH·的清除达89.99%，其IC50值为0.071 g/L；当桑椹多糖质量浓度在1.0 g/L时对DPPH·清除率达81.25%，其IC50值为0.376 g/L。因此，桑椹多糖粗提物可作为天然抗氧化剂应用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F006图6桑椹多糖粗提物对DPPH·清除能力2.3.2桑椹多糖粗提物对OH·清除能力（见图7）由图7可知，当桑椹多糖浓度在0.05~1.0 g/L范围内时，其对OH·清除率随着样品浓度的增加而呈上升趋势，表现出良好的量效关系，但在相同质量浓度时桑椹多糖对OH·清除能力低于VC。当桑椹多糖质量浓度为1.0 g/L时，对OH·清除率达到86.54%，其IC50值为0.244 g/L，而VC的IC50值为0.065 g/L。因此，表明桑椹多糖提取物对OH·具有一定的清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.21.018.F007图7桑椹多糖粗提物对OH·清除能力3讨论桑椹多糖具有很多的潜在价值，可代替抗生素促进动物生长，具有开发成饲料添加剂和兽药的潜力。在单因素试验基础上，采用响应面法对提取工艺进行优化。结果表明，影响桑椹多糖提取得率的因素排序为：功率温度时间液料比。体外抗氧化活性研究表明，桑椹多糖对DPPH·和OH·具有一定清除能力，在一定浓度内均呈现剂量关系。在DPPH·和OH·试验中发现桑椹多糖的抗氧化活性均远低于VC，但在一定浓度下桑椹多糖具有抑制自由基生成的作用，其IC50值分别为0.376和0.244 g/L。因此，桑椹多糖粗提物有望开发为天然抗氧化剂，桑椹多糖作为一种新型饲料添加剂具有较好的开发价值和广阔的应用前景。4结论本试验以桑葚为研究对象，对桑葚中功能活性成分多糖进行提取。桑椹多糖的最佳提取工艺条件为提取温度55 ℃、液料比20 mL/g、提取功率180 W、提取时间30 min，在此条件下桑椹多糖的实际提取得率为10.54%，与预测值10.98%基本相符，表明应用Design-Expert8.0.6软件得到的多糖提取工艺参数真实可靠，具有实际应用价值，可为提取桑葚多糖的研发提供参考。