秸秆作为农业资源副产物，可用作生活燃料、草食家畜饲料、肥料、造纸工业、建筑业及手工业原料，但以上方法对秸秆的利用率较低且容易造成环境污染。秸秆饲料化具有便捷、环保等优势，不仅可减少因其焚烧或堆积而造成的环境污染，而且还可缓解饲料资源缺乏的压力[1]。然而，秸秆饲料化在反刍动物体内消化率较低，主要原因在于秸秆的内部结构较为复杂。秸秆主要是由纤维素（38%~44%）、半纤维素（32%~36%）以及木质素（10%~15%）组成。半纤维素和木质素先是形成类似网络的复杂结构，然后纤维素再与其结合，共同构成玉米秸秆的支撑骨架[2]。为了提高秸秆的营养价值和利用率，需破坏秸秆内部的复杂结构。因此，很多研究人员致力于探索不同的方式对其进行加工处理，目前已有物理、化学和生物处理这几种方法[3-4]。相比较而言，生物处理可以有效改善玉米秸秆的化学组分，提高其消化率，并以微生物处理应用最广泛[5]。其中，真菌处理效率远高于细菌处理效率，且真菌处理秸秆具有环保、安全、卫生等优势[6-7]。前人研究结果中，真菌作为降解木质纤维素的优势微生物，降解最快的是担子菌[8]。最近研究最多的是属担子菌中的白腐真菌，可对木质素的共价键有一定的破坏作用，进而选择性降解秸秆木质素[9-10]。因此，本试验选择隶属于白腐真菌[11-12]，也是常用的食用菌的Lentinus edodes和Pleurotus eryngii为试验菌株，以期探索白腐真菌中可食用菌属对玉米秸秆纤维结构的作用及效果。碳水化合物是反刍动物最重要的营养物质之一，其利用效率与内在空间结构密切相关。一般采用湿化学分析法来测定其含量，但此方法并不能够完全揭示分子结构与营养成分的关系。近年来，有学者致力于探索采用傅里叶红外光谱法测定饲二级分子结构及内部空间结构，以从分子结构方面分析饲料品质优劣。傅里叶红外光谱法（fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）是一种获取干涉图信号后经计算机完成离散傅里叶变换，计算获得光谱图，将分子结构特征与光谱图联系起来的光谱技术[13]。该技术可对固体、液体、气体等各形态样品进行定性和定量分析，广泛应用于医药化工、地矿、石油、煤炭、环保等领域，具有直接、快速、适用性广泛等优点[11,14-16]。随着这项技术的成熟，越来越多的人运用光谱法来检测饲料蛋白质和碳水化合物的二级结构[17-18]，观察并分析饲料内部的分子结构，进而从分子水平揭示饲料营养价值的差异[19]。因此，本研究以玉米秸秆为试验材料，研究真菌处理对玉米秸秆二级分子结构和纤维成分变化的影响，旨在为秸秆饲料化的合理利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1饲料秸秆从河北省采集同一品种（品种：纪元128），3个地块的玉米秸秆，分别粉碎至2~3 cm，风干后放入密闭自封袋中保存待用。1.1.2培养真菌自广东微生物所购置Lentinus edodes-513、Lentinus edodes-520、Lentinus edodes-5192； Pleurotus eryngii-5280真菌，放入4 ℃冰箱冷藏。1.2试验方法1.2.1原代菌种扩繁取去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1 L煮沸30 min，滤去马铃薯，定容至1 L，制得马铃薯浸取液。之后，加入葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，维生素B1微量，琼脂15.0 g，制作培养基平板。各个真菌菌种（Lentinus edodes-513、Lentinus edodes-520、Lentinus edodes-5192；Pleurotus eryngii-5280）分别扩培后接种至培养基平板上。将制备好的培养基分装置试管后，于121 ℃高压灭菌1 h，取出后放置斜面冷却，用30 cm接种铲将原代真菌分别接种到试管斜面中。1.2.2高粱定植真菌1 kg高粱放入沸水中煮约20~30 min，将水分过滤后，高粱装至800 mL培养瓶中，121 ℃高压灭菌1 h，冷却后将琼脂平板中的真菌菌丝接种至高粱中，控制环境温度为25 ℃、湿度为70%。玉米秸秆用自来水浸泡72 h，高温121 ℃灭菌处理1 h，秸秆和耐高温的塑料瓶子，静置冷却后备用。将生长约1周的高粱定植菌丝混合入湿润的秸秆中，将混合比例为260 g湿秸秆与5 g高粱的混合物放入培养箱中，控制环境温度为25 ℃、湿度为70%。分别于培养0、1、3、6、9和12周采集饲料样品。烘干，粉碎后过40目分析筛待测，每个样品设置3个重复。1.3测定指标及方法1.3.1湿化学法测定营养指标利用全自动纤维分析仪测定不同真菌不同处理时间的玉米秸秆中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、酸性洗涤木质素（ADL）的含量。测定方法依据Van Soest方法进行[20]。1.3.2中红外法测定分子结构将待测样品用粉碎机粉碎后过0.25 mm分析筛，启动Lambda ATR-FT/IR（天津港东科技有限公司），采集所用样品的光谱图，每个样品平行扫描10次，扫描波段为4 000~400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为64次，24个样品共采集240个图谱，同时采集空白图谱以免除环境因素的影响。将所采集的GIF格式图谱转化为CSV格式，等待分析。利用电脑软件逐步解析不同真菌以及不同处理时间玉米秸秆所采集的图谱。其中，碳水化合物分子结构特征参数包括总碳水化合物第一亚峰峰高（TCHO1H）及峰面积（TCHO1A）、总碳水化合物第二亚峰峰高（TCHO2H）及峰面积（TCHO2A）、总碳水化合物第三亚峰峰高（TCHO3H）及峰面积（TCHO3A）、结构性碳水化合物吸收峰的峰高（STCHOH）及峰面积（STCHOA）和总碳水化合物吸收峰的总峰高（TCHOH）及总峰面积（TCHOA）。此外，还包括木质素吸收峰的峰高（LH）和峰面积（LA）；纤维素吸收峰的峰高（FH）和峰面积（FA）。采集图谱后，使用OMNIC 8.2分析各营养物质的范围，木质素的基线区域在ca.1 592~1 511 cm-1附近，结构性碳水化合物的基线区域在ca.1 587~1 147 cm-1附近，纤维素的基线区域在ca.1 392~1 103 cm-1附近，总碳水化合物第一亚峰的基线区域在ca.1 274~1 068 cm-1附近，总碳水化合物第二亚峰的基线区域在ca.1 201~1 039 cm-1附近，总碳水化合物第三亚峰基线区域在ca.1 145~848 cm-1附近。1.4数据统计与分析试验按照2×2因素设计[21]，NDF、ADF、ADL含量与分子结构单变量图谱数据采用SAS 9.2的MIXED程序进行分析，数据均采用以下分析模型：Y=F1+F2+F1×F2+μ+erro。其中F1为真菌处理影响；F2为处理时间影响；F1×F2为二因素互作；erro为随机标准误。利用SPSS 22.0中的Spearman分析不同真菌处理不同处理时间的玉米秸秆各个二级结构特征参数与NDF、ADF、ADL的相关性。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1不同真菌不同时间处理玉米秸秆纤维成分的影响（见表1）由表1可知，不同真菌处理对玉米秸秆的纤维成分NDF、ADF、ADL都呈极显著影响（P0.01）；不同处理时间对玉米秸秆的纤维成分NDF、ADF、ADL都呈极显著影响（P0.01）；真菌处理和时间二者的交互作用对NDF、ADF亦均呈极显著影响（P0.01），对ADL影响显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.019.T001表1不同真菌不同处理时间对玉米秸秆中NDF、ADF及ADL含量影响项目处理时间/wSEMP值L-513L-520L-5192P-52800136912F1F2F1×F2NDF65.87b63.92c65.13bc70.77a66.68b69.39a67.18b66.99b65.17b63.14c0.5990.010.010.01ADF53.46ab52.22bc51.15c53.92a47.65d50.00c53.85b53.50b55.59a55.54a0.5260.010.010.01ADL6.37b6.50b6.24b10.11a7.82ab8.51a8.18ab6.85b7.10b5.36c0.3420.010.010.039注：同列数据肩标相同字母表示无显著差异（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05，P0.01）；下表同。%Pleurotus eryngii-5280处理组的NDF、ADL均显著高于其他3组（Lentinus edodes-513、Lentinus edodes-520、Lentinus edodes-5192）；12周处理组的NDF显著低于其他处理组（0、1、3、6、9处理组），3、6、9周处理组的NDF无显著差异但其均显著低于1周处理组；1、3、6、9、12周处理组的ADF均显著高于0周的未处理组，9、12周处理组均显著高于3、6处理组，3、6处理组均显著高于1周处理组；6、9、12周处理组的ADL显著低于0、1、3周处理组，12周处理组显著低于6、9周处理组（此两组之间差异不显著）。2.2不同真菌不同时间处理玉米秸秆二级分子结构差异（见表2）由表2可知，不同真菌处理对木质素峰高及峰面积、结构性碳水化合物峰高、纤维素峰高及峰面积、总碳水化合物的第一亚峰峰高及峰面积、总碳水化合物的第二亚峰峰高及峰面积和总碳水化合物总峰高均呈极显著影响（P0.01）；不同处理时间对总碳水化合物的第一亚峰峰高呈显著影响（P0.05），对纤维素峰高及峰面积、总碳水化合物的第一亚峰峰面积、总碳水化合物的第二亚峰峰面积、总碳水化合物的第三亚峰峰高及峰面积和总碳水化合物总峰高及总峰面积均呈极显著影响（P0.01）；真菌处理×时间二者交互效果对碳水化合物分子指标均无显著影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.019.T002表2真菌处理玉米秸秆的二级分子结构特征参数项目处理时间/wSEMP值L-513L-520L-5192P-52800136912F1F2F1×F2LH(10-2)0.10b0.12b0.18b0.40a0.22a0.21a0.17a0.16a0.20a0.25a0.0990.010.750.34LA(10-2)1.14b1.42b2.24b4.67a2.63a2.60a1.91a1.57a2.46a3.03a1.2560.010.480.11STCHOH(10-2)0.46b0.54b0.43b0.77a0.83a0.48bc0.51bc0.40c0.43bc0.63ab0.1800.010.050.85STCHOA(10-2)46.64a3 5.02a51.41a73.85a84.97a53.24a63.03a34.98a43.07a53.28a52.2240.580.510.62FH(10-2)0.22c0.29b0.24bc0.34a0.39a0.33ab0.27bc0.26bc0.21cd0.17d0.0460.010.010.31FA(10-2)8.33b9.96b9.25b14.27a15.89a13.15a10.23b9.48b8.24bc5.73c1.8640.010.010.22TCHO1H(10-2)0.26b0.32b0.33b0.42a0.43a0.36abc0.36ab0.32abc0.30bc0.24c0.0730.010.020.09TCHO1A(10-2)6.10b7.24b6.66b9.12a9.69a7.78b7.00bc6.38bc7.30bc5.53c1.1340.010.010.32TCHO2H(10-2)0.13b0.17b0.17b0.27a0.22a0.23a0.19a0.15a0.17a0.16a0.0530.010.090.49TCHO2A(10-2)2.74b3.14b2.78b5.23a4.23a4.10a4.14a2.94b2.71b2.72b0.6740.010.010.30TCHO3H(10-2)1.87b2.18ab1.98b2.24a2.65a2.14b1.97bc1.89bc2.01bc1.74c0.2800.080.010.57TCHO3A(10-2)155.84b184.21ab164.34b182.40a219.71a180.07b167.99b157.26bc166.37bc138.78c24.0330.110.010.85TCHOH(10-2)2.27b2.66b2.48b2.93a3.29a2.73b2.51bc2.35bc2.48bc2.14c0.3480.010.010.46TCHOA(10-2)163.68b193.90ab173.28b196.28a233.32a191.43b178.37b165.76bc175.75bc146.08c24.2120.070.010.83Pleurotus eryngii-5280处理组LH、LA、STCHOH、FH、FA、TCHO1H、TCHO1A、TCHO2H、TCHO2A、TCHOH均显著高于其他3组（Lentinus edodes-513、Lentinus edodes-520、Lentinus edodes-5192）；Lentinus edodes-513、Lentinus edodes-520、Lentinus edodes-5192、Pleurotus eryngii-5280处理组STCHOA无显著差异；不同处理时间LH、LA、STCHOA和TCHO2H无显著差异；处理12周FH、FA均显著低于处理0、1、3、6、周，与处理9周的无显著差异；处理12周的TCHO1A、TCHO3H、TCHOH均显著低于处理0、1周，与处理3、6、9周无显著差异；处理12周的TCHO3A、TCHOA均显著低于处理0、1、3周，与处理6、9周无显著差异；处理6、9、12周TCHO2A均显著低于处理0、1、3周。2.3不同真菌不同处理时间玉米秸秆纤维组分与二级分子结构特征参数的相关性（见表3）由表3可知，NDF的含量与TCHO2H、TCHO3H、TCHO3A和TCHOA呈显著正相关（P0.05），与FH、FA、TCHO1H、TCHO1A和TCHO2A呈极显著正相关（P0.01），其中与FA的相关系数最高达到0.714。ADF的含量与STCHOA、TCHO1H、TCHO3H和TCHOH呈显著负相关（P0.05），与FH、FA、TCHO3A和TCHOA呈极显著负相关（P0.01），其中与TCHO3A的相关系数最低达到-0.553。ADF与其他二级分子结构相关性不显著（P0.05）。ADL的含量与LH呈显著正相关（r=0.432，P0.05），与STCHOA、FH、FA、TCHO1H、TCHO1A、TCHO2H、TCHO2A、TCHO3H、TCHO3A、TCHOH和TCHOA呈极显著正相关（P0.01），其中与FA的相关系数最高达到0.806，与LA和STCHOH之间无显著相关关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.02.019.T003表3不同真菌不同处理时间玉米秸秆NDF、ADF、ADL与二级分子结构特征参数的相关性项目NDFADFADLrPrPrPLH(10-2)0.3860.062-0.0380.8600.4320.035LA(10-2)0.3690.076-0.0260.9040.3620.082STCHOH(10-2)0.1080.614-0.2850.1770.2670.207STCHOA(10-2)0.3940.057-0.5040.0120.5750.01FH(10-2)0.6820.01-0.5470.010.7450.01FA(10-2)0.7140.01-0.5370.010.8060.01TCHO1H(10-2)0.5900.01-0.4860.0160.5510.01TCHO1A(10-2)0.5140.01-0.3570.0860.5570.01TCHO2H(10-2)0.4500.027-0.3270.1190.6690.01TCHO2A(10-2)0.6290.01-0.3680.0770.7440.01TCHO3H(10-2)0.4550.025-0.4730.0200.5640.01TCHO3A(10-2)0.4440.030-0.5330.010.5630.01TCHOH(10-2)0.5080.110-0.4440.0300.6150.01TCHOA(10-2)0.4830.017-0.5250.010.6020.01注：r=Spearman相关系数，横列与纵列相关性比对为同一样品。%3讨论3.1不同真菌不同处理时间对玉米秸秆各纤维成分含量及其分子结构特征的影响传统的焚烧处理秸秆的方式对环境污染极大，越来越多的研究人员更注重研究环保的有效利用数量巨大的秸秆的方法，因此各种各样的处理方式相继涌现，如秸秆还田、秸秆制炭、秸秆发电、秸秆炭基肥。其中，研究人员针对秸秆饲用化方面的进行大量研究，主要以甜高粱、玉米、芦苇、棉花等秸秆粉碎加工形成纤维饲料。但以上方法均需要将所有的原料粉碎后再进行混合，增加处理的烦琐程度，且不能为反刍动物提供足够的长纤维。因此，本课题组在前人研究基础上，进一步研究采用真菌处理长度为3~5 cm的玉米秸秆，以期达到真菌改善玉米秸秆纤维组分，又可以将处理后玉米秸秆作为反刍动物日粮原料的目的。本试验着重分析采用不同真菌、不同时间处理玉米秸秆以二者互作对玉米秸秆纤维成分的影响。本试验表明，Lentinus edodes 3个处理组（Lentinus edodes-513、Lentinus edodes-520、Lentinus edodes-5192）的NDF、ADL含量均显著低于Pleurotus eryngii-5280处理组；真菌处理玉米秸秆随着时间的延长，玉米秸秆NDF及ADL含量极显著降低（P0.01），这与代小伟[22]的研究结果一致，说明随着真菌处理时间延长，可有效改善玉米秸秆纤维组分。本试验Lentinus edodes 3个处理组的LA、FA、TCHO1A、TCHO2A均显著低于Pleurotus eryngii-5280处理组，分子结构参数和纤维组分水平均表明Lentinus edodes处理组的效果比Pleurotus eryngii更佳。3.2不同真菌不同处理时间对玉米秸秆纤维成分与其二级分子结构特征参数相关性分析本试验对不同真菌不同处理时间玉米秸秆的NDF、ADF、ADL含量与二级分子结构特征参数的相关性进行分析。NDF、ADF、ADL含量与STCHOH均无相关性，Zhang等[23]研究表明，STCHO与所有化学常规参数均无相关性，本试验结果与该结果相似，表明STCHO不能作为预测这些玉米秸秆营养状况的指标。Zhang等[23]等研究显示，NDF、ADF、ADL含量与LH均呈极显著正相关，与TCHO呈显著负相关，本试验与该结果不一致，可能与所取样品和试验处理不同有关；NDF、ADL含量与FH、FA均呈正相关，这与Zhang等[23]的研究报道一致，说明FH、FA越高，中性洗涤纤维和木质素的含量越高。本试验中，NDF与FA、FH、TCHO1H、TCHO1A、TCHO2H、TCHO2A、TCHO3H、TCHO3A、TCHOA均呈正相关，与FA相关系数最高，达0.714；ADL与LH、FH、FA、TCHO1H、TCHO1A、TCHO2H、TCHO2A、TCHO3H、TCHO3A、TCHOH、TCHOA均呈正相关，与FA相关系数最高，达0.806。NDF、ADL均与FA呈正相关，与Zhang等[24]的试验结果一致。说明真菌处理能通过改变FA结构来影响秸秆纤维成分含量。且本试验中Lentinus edodes 3个处理组的FH与FA均显著低于Pleurotus eryngii-5280处理组，且在Lentinus edodes 3个处理组的NDF、ADL含量均显著低于Pleurotus eryngii-5280处理组，进一步说明相比于Pleurotus eryngii-5280，Lentinus edodes处理可更显著改善玉米秸秆二级分子结构中的纤维素峰高及峰面积，进而影响其NDF及ADL含量，达到改善玉米秸秆品质的效果。在Lentinus edodes 3个处理组中，Lentinus edodes-513处理组的FH和FA均最低，表明Lentinus edodes-513处理组最优。本试验结论进一步印证，二级分子结构改变会影响常规营养组分含量，真菌处理可有效改善玉米秸秆分子结构进而影响其营养组分含量。4结论真菌处理能够降低玉米秸秆纤维分子结构，主要改变FH与FA结构，进而影响玉米秸秆纤维成分的含量。综合纤维组分含量及分子结构水平表明Lentinus edodes处理组的效果比Pleurotus eryngii更佳，Lentinus edodes处理组中Lentinus edodes-513的处理效果最佳。