乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和光合细菌是常用的动物微生态制剂[1]。芽孢杆菌能够耐高温、耐挤压、耐酸、耐胆盐，形成内生孢子，孢子进入动物肠道后仅需较短时间就能够萌发复活，发挥益生作用[2]。芽孢杆菌能够产生抗菌物质，阻止病原微生物在宿主肠道上皮细胞定植，分泌胞外酶，帮助宿主消化食物，促进动物消化吸收[3]。芽孢杆菌能够增强动物机体的免疫力，促进肠道器官发育[4-5]。芽孢杆菌在我国畜禽养殖和水产养殖中也得到了广泛的应用和推广[6]，但芽孢杆菌的益生作用效果还有待进一步提高。芽孢杆菌在动物体内的定植与增殖是影响芽孢杆菌在体内发挥益生作用的基础[7-8]。动物消化道的益生菌能够更好地在动物体内定植与增殖，因此从动物消化道分离优良菌株的益生菌效果较好。本试验从马的肠道中分离芽孢杆菌，测定其细菌菌落形态和生理特性，筛选培育了5株芽孢杆菌，对所分离5株菌进行鉴定及系统进化分析，以期获得马源天然菌种。1材料与方法1.1试验材料试验样品：5匹健康成年马的新鲜粪便采自北京农业职业学院马术运动实践教学活动中心。培养基与试剂：营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、染色液、生化试剂均购自北京陆桥技术股份有限公司；双链DNA试剂盒、PCR扩增试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司。仪器与设备：Qubit 4.0 Fluorometer荧光分光光度计，伯乐PowerPac Basic、Wide Mini-Sub® Cell GT 水平电泳槽，Applied Biosystems 9700PCR基因扩增仪，北京赛智创业科技Champchemi凝胶成像仪。1.2测定指标及方法1.2.1样品处理在超净工作台内无菌操作，从新鲜马粪的中心挑取适量样品，放入灭菌好的营养肉汤培养基中，使用接种环打撒后振荡混匀，放入恒温生化培养箱，37 ℃培养4~5 d。培养结束将肉汤培养物放入离心管中，2 000 r/min离心10 min，离心管置于90 ℃水浴锅内水浴20 mim。1.2.2细菌的分离培养取水浴结束后的菌液分别划线接种于营养琼脂平板培养基和麦康凯琼脂平板培养基，恒温培养箱37 ℃恒温培养24 h，挑取疑似菌落多次划线分离，直至获得纯培养物。1.2.3纯培养物的染色观察挑取纯培养物在洁净的载玻片上进行抹片干燥固定，分别使用革兰氏染色液和芽孢染色液进行染色，显微镜油镜观察培养物的状态及菌种的形态特点。1.2.4细菌的生化试验将获得的纯培养物接种至肉汤培养基增菌培养，取菌液分别接种于糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、淀粉培养基、明胶培养基，37 ℃培养1~3 d观察结果。1.2.5菌株的16S rDNA序列测定及系统进化分析1.2.5.1基因组DNA提取在超净工作台将实验室冰箱中冷藏保存在琼脂斜面培养基上的5株芽孢菌菌种（分别为QM、BM、Y1M、Y2M、Z2M）接种至灭菌的营养肉汤培养基中进行活化复苏，37 ℃恒温培养箱振荡培养过夜，取1.5 mL菌体培养物放入离心管，12 000 r/min离心2 min，吸净上清，沉淀物使用CTAB基因组提取法[9]对细菌进行DNA提取。1.2.5.2基因组DNA浓度及纯度检测采用Qubit 4.0 Fluorometer荧光分光光度计测定检测菌株中的DNA浓度。按照试剂盒的说明准备好标准品，取1 μL上述提取的基因组DNA原液，配制好样品。使用标准品校正，取2 μL提取好的基因组DNA原液，加入2 μL的gelgreen，使用离心机混匀，在质量分数为1%的琼脂糖凝胶中点样，120 V电泳20 min，使用溴化乙锭染色20~30 min，采用凝胶成像系统观察分析电泳结果。1.2.5.3PCR产物扩增及其检测以基因组DNA为PCR扩增模板，采用细菌16S rDNA扩增通用引物，引物序列为：27F：5'-TGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1 492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'。PCR扩增体系（50 μL）：2×Phata Buffer 12.5 μL、dNTP（2.5 nmol/L) 0.5 μL、Primer 27F（10 μmol/L）1.0 μL、Primer 1 492R（10 μmol/L）1.0 μL、Genomic DNA 20.0 ng、Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至25.0 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共28个循环，72 ℃终延伸7 min，4 ℃，∞。取PCR扩增产物2 μL加入2 μL溴酚蓝染色液混匀，加入1.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）上，1×TAE缓冲液中恒压150 V电泳20 min，电泳结束后在凝胶成像仪下观察结果。1.2.5.416S rDNA序列测定及系统进化分析将PCR扩增产物送至北京赛默百合生物科技有限公司进行基因测序，将测序结果提交到NCBI核酸数据库，使用BLAST程序与数据库中的序列作对比，确定菌株种属。根据序列相似性，利用MEGA软件，对5株菌和5个参考序列构建进化树。2结果与分析2.1细菌分离培养结果（见表1）由表1可知，QM、BM、Y1M、Y2M、Z2M在肉汤培养基中都呈现均匀混浊，底部有黏性沉淀，有菌膜；在营养琼脂培养基上，QM、BM、Y1M、Y2M形成灰白色圆形干燥型菌落，表面扁平、粗糙、无皱缩的菌落，而Z2M形成灰白色干燥型菌落，菌落表面扁平、粗糙、明显皱缩；在麦康凯培养基上所有菌株都不生长，分离培养结果符合芽孢杆菌的特点。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.022.T001表1菌株分离培养的结果菌株肉汤培养基营养琼脂培养基麦康凯培养基QM均匀混浊，底部有黏性沉淀，有菌膜灰白色圆形干燥型菌落，表面扁平、粗糙、无皱缩基本不生长BM均匀混浊，底部有黏性沉淀，有菌膜灰白色圆形干燥型菌落，表面扁平、粗糙、无皱缩基本不生长Y1M均匀混浊，底部有黏性沉淀，有菌膜灰白色圆形干燥型菌落，表面扁平、粗糙、无皱缩基本不生长Y2M均匀混浊，底部有黏性沉淀，有菌膜灰白色圆形干燥型菌落，表面扁平、粗糙、无皱缩基本不生长Z2M均匀混浊，底部有黏性沉淀，有菌膜灰白色干燥型菌落，表面扁平、粗糙、明显皱缩基本不生长2.2菌株染色观察结果（见表2）由表2可知，QM、BM、Y1M、Y2M、Z2M革兰氏染色结果均为革兰氏阳性菌（G+），粗长、短链、有中央芽孢的杆菌；芽孢染色结果显示，芽孢均呈绿色，繁殖体呈红色，培养144 h，菌体90%成为芽孢。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.022.T002表2菌株染色观察的结果菌株革兰氏染色芽孢染色QMG+，粗长、短链、有中央芽孢杆菌芽孢呈绿色，繁殖体呈红色，培养144 h，菌体90%成为芽孢BMG+，粗长、短链、有中央芽孢杆菌芽孢呈绿色，繁殖体呈红色，培养144 h，菌体90%成为芽孢Y1MG+，粗长、短链、有中央芽孢杆菌芽孢呈绿色，繁殖体呈红色，培养144 h，菌体90%成为芽孢Y2MG+，粗长、短链、有中央芽孢杆菌芽孢呈绿色，繁殖体呈红色，培养144 h，菌体90%成为芽孢Z2MG+，粗长、短链、有中央芽孢杆菌芽孢呈绿色，繁殖体呈红色，培养144 h，菌体90%成为芽孢2.3菌株的生化鉴定结果（见表3）由表3可知，QM、BM、Y1M、Y2M、Z2M可分解葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇和果糖产酸（QM不能分解蔗糖，Y2M不能分解麦芽糖），甲基红试验、淀粉水解酶试验均为阳性，吲哚试验、明胶液化试验均为阴性，生化鉴定结果基本符合芽孢杆菌的生化特性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.022.T003表3菌株生化鉴定的结果菌株葡萄糖乳糖蔗糖麦芽糖甘露醇果糖吲哚试验甲基红试验淀粉水解酶试验明胶液化试验QM++++++-++-BM++++++-++-Y1M++++++-++-Y2M+++-++-++-Z2M++++++-++-注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。2.4菌株的16S rDNA序列测定及系统进化分析结果2.4.1基因组DNA提取物浓度及纯度检测结果（见表4）使用CTAB基因组提取法提取得到5株菌的基因组DNA，Qubit 4.0 Fluorometer荧光分光光度计检测DNA浓度。由表4可知，5株菌的基因组DNA中Y1M的浓度最低为3.9 μg/L，Z3M最高为56.6 μg/L，各菌株的浓度之间虽有差别，但荧光定量技术可以特异性地定量低浓度溶液中的双链DNA，而不受溶液中存在的RNA和蛋白质等污染物的影响，表明各株菌均成功提取到DNA。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.022.T004表4基因组DNA提取物浓度及纯度检测结果项目Y1MBMY2MZ3MQM浓度3.913.043.256.628.4μg/L基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果见图1。由图1可知，5株菌的样本浓度不一样，条带光亮度也不同，但各样本均在5 000 bp以上处出现荧光条带，可以用于后续16S rDNA鉴定PCR扩增及DNA测序。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.022.F001图1基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果注：1为Y1M；2为BM；3为Y2M；4为Z3M；5为QM；6为DNA Marker DL 5 000 bp。2.4.2PCR扩增产物浓度（见表5）由表5可知，扩增产物的浓度最低为73.2 μg/L，最高为86.3 μg/L，OD260 nm/OD280 nm的比值均在2.0附近，各样本扩增产物浓度相近，纯度较好，能够满足后续测序的需要。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.022.T005表5PCR扩增产物浓度项目QMBMY1MY2MZ2M浓度/(μg/L)84.776.973.286.379.5OD260 nm/OD280 nm值1.941.992.022.081.932.4.3琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物结果（见图2）由图2可知，5株菌样品16S rDNA PCR扩增产物在约1 500 bp处出现荧光条带，表明PCR扩增成功，且符合16S rDNA片段大小，与预期大小一致，能够满足后续16S rDNA序列测定的需要。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.022.F002图2琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物结果注：1为QM；2为BM；3为Y1M；4为Y2M；5为Z2M；6为DNA Marker DL 5 000 bp。2.4.4系统发育树的构建利用NCBI中的BLAST软件，将5个菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对。BLAST结果显示，QM与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的同源性为100%（登录号：KY317953.1），BM与Bacillus cereus的同源性为99%（登录号：MK014289.1），Y1M与Bacillus cereus的同源性为98%（登录号：MW453077.1），Y2M与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的同源性为99%（登录号：KY129662.1），Z2M与赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus macroides）的同源性为99%（登录号：MG008673.1）。由图3可知，QM、BM、Y1M属于同一分支中，与Bacillus cereus不同菌株的同源性达95%以上，因此认定QM、BM、Y1M为蜡样芽孢杆菌；Y2M与Bacillus amyloliquefaciens的同源性为99%，与QM、BM、Y1M的属性同源达56%。《伯杰氏系统细菌学手册》指出同源性在20%~60%之间认为是同一属中的不同菌种，表明Y2M属于芽孢杆菌属，结合前期的形态和生化特性，确定Y2M是芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌；Z2M与Lysinibacillus macroides的同源性为99%，与QM、BM、Y1M、Y2M的同源性为35%，表明Z2M属于芽孢杆菌属，结合试验中Z2M形态特征、生理生化及16S rDNA鉴定结果，确定Z2M为芽孢杆菌属的赖氨酸芽孢杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.022.F003图3系统进化树3讨论马属于单胃食草动物，肠道十分发达。马的盲肠是胃容量的十多倍，是马匹的重要消化器官，盲肠中有丰富的厌氧微生物群体，这些微生物在维持肠道健康和肠道功能发挥方面重要的生理作用[10]。马的许多肠道疾病（如腹胀、肠梗阻、结肠炎）可能与微生物群组成或功能的改变有关，因此保持肠道微生物的平衡和稳定对维持肠道健康具有重要意义[11]。利用微生态制剂可以调控马属肠道微生物的活动，从而增强马属动物的消化功能，充分发挥其运动性能[12]。不同动物肠道内的益生菌不一样，异源性益生菌必须经过竞争、定植和排斥等过程在动物体内存活，而同源性益生菌因其同源性，能够快速在肠道内定植，平衡肠道菌群，发挥益生效果[13]。目前关于马营养和健康发育等方面的研究报道较少[11]。伊如格勒图[14]研究蒙古马肠道细菌多样性，发现枯草芽孢杆菌具有降解纤维功能，是一种多功能益生菌。苏少锋[11]在对蒙古马胃肠道细菌群落组成及纤维素分解菌的研究中筛选得到解淀粉芽孢杆菌C14，且该菌产酶强，具有较强的纤维素分解能力。芽孢杆菌是一类能耐高温（80~85 ℃）、抗性强（耐挤压、耐酸、耐胆盐）、能够形成内生孢子的好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌，且芽孢孢子在饲料加工和储藏运输过程中能保持相对稳定，孢子进入肠道能够迅速萌发并大量增殖，从而发挥强大的益生作用。目前，用于微生态制剂的芽孢杆菌主要是枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌[15]。本试验分离得到的菌株3株为蜡样芽孢杆菌，1株为解淀粉芽孢杆菌，1株为赖氨酸芽孢杆菌。蜡样芽孢杆菌为常用益生菌，解淀粉芽孢杆菌具有较强的益生性能，赖氨酸芽孢杆菌作为益生菌的研究较少。4结论本试验通过传统的细菌形态特征、生理生化反应特征，初步确定QM、BM、Y1M、Y2M、Z2M为芽孢杆菌。通过16S rDNA序列同源性比较和系统发育分析，进一步确定QM、BM、Y1M均为蜡样芽孢杆菌，Y2M为解淀粉芽孢杆菌，Z2M为赖氨酸芽孢杆菌。未来本课题组将进一步研究所选菌种的益生特性，为其作为饲料添加剂提供参考。