肉豆蔻（Myristica fragrans）又名肉果等，在我国云南、广东等地区栽培种植[1]。肉豆蔻中的多酚类物质，具有抗氧化、抑菌等生物活性[2]。近年来，植物多酚在畜牧业和动物疫病中发挥重要作用，应用十分广泛。在饲料中添加植物多酚可以增强动物对营养物质的消化和吸收，调节肠道菌群，提高机体免疫力[3]。植物多酚对由毒物所引起的畜禽机体组织损伤还具有较好的缓解作用[4]。雷宇杰等[5]研究发现，在饵料中加入茶多酚能够促进马口鱼生长，提高马口鱼的天然免疫反应和抗病力。赖兴富等[6]研究发现，日粮中加入茶多酚能够显著提高蛋鸡的产蛋率、平均蛋重，降低料蛋比。孙廷等[7]研究发现，在育肥猪的日粮中加入400 mg/kg的植物多酚可有效改善育肥猪的肉品质，提高育肥猪的平均日增重和饲料转化率。肖红艳等[8]研究发现，日粮中加入茶多酚对奶山羊的采食量和产奶量无明显的影响，但能够提高机体的抗氧化能力。本试验以肉豆蔻为原料，利用超声波协同纤维素酶法优化肉豆蔻多酚提取工艺条件，研究肉豆蔻多酚的体外的抗氧化性，为后期肉豆蔻多酚在动物生产中的综合利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料与试剂试验材料：肉豆蔻购自锦州市比优特超市，纤维素酶（35 U/mg）购自南京都莱生物技术有限公司。没食子酸购自南京都莱生物技术有限公司。主要试剂：碳酸钠、高硫酸钾、无水乙醇、抗坏血酸（VC）、福林酚试剂购自国药集团化学试剂有限公司；DPPH、ABTS试剂购自福州飞净生物科技有限公司，上述试剂均为分析纯。1.2试验仪器FZ102微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、JD200-3电子天平（沈阳天平仪器有限公司）、KQ5-250DE超声波清洗器（昆山舒美仪器有限公司）、UV-5100B紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）、GL20M高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、电热恒温水浴锅（湖南力辰仪器科技有限公司）。1.3测定指标及方法1.3.1肉豆蔻提取液的制备肉豆蔻经低温烘干，粉碎，过40目筛，获得肉豆蔻粉末。准确称取1 g肉豆蔻粉末置于锥形瓶中，加入95%的乙醇溶液，加入适量的纤维素酶（5 g/L），300 W的超声波清洗器中进行提取。将处理后的样品放入离心机中，3 900 r/min离心30 min，取上清液。1.3.2没食子标准曲线的绘制根据杨文平等[9]的方法，稍作改动。称取没食子酸标准品，配成浓度为0.1 g/L的标准溶液。分别吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL没食子酸，加入25 mL试管中，加5 mL蒸馏水、0.8 mL福林酚试剂混匀，5 min后，加1.8 mL 20%碳酸钠溶液，定容至刻度线，25 ℃暗室反应2 h；做试剂空白，在765 nm处测吸光度，绘制标准曲线。1.3.3肉豆蔻多酚得率采用福林酚法测定肉豆蔻多酚得率。将上清液定容至10 mL，分别依次吸取0.1 mL，根据标准曲线确定的方法，测定吸光度，计算肉豆蔻多酚得率[10]。肉豆蔻多酚得率=cV1 000×m×100% （1）式中：c为提取液多酚质量浓度（g/L）；V为提取液体积（mL）；m为样品质量（g）。1.3.4单因素试验设计1.3.4.1纤维素酶添加量对肉豆蔻多酚得率的影响准确称取6份1 g的肉豆蔻粉末，分别置于100 mL圆底烧瓶中，在酶解温度50 ℃、超声时间60 min、超声功率300 W的条件下，分析纤维素酶添加量分别为0.3、0.7、1.1、1.5、1.9、2.3 g/L时对肉豆蔻多酚得率的影响。1.3.4.2酶解温度对肉豆蔻多酚得率的影响准确称取6份1 g的肉豆蔻粉末，分别置于100 mL的圆底烧瓶中，在纤维素酶添加量1.5 g/L、超声时间60 min、超声功率300 W的条件下，分析酶解温度分别为20、30、40、50、60、70 ℃时对肉豆蔻多酚得率的影响。1.3.4.3超声时间对肉豆蔻多酚得率的影响准确称取6份1 g的额肉豆蔻粉末，分别置于100 mL圆底烧瓶中，在纤维素酶添加量1.5 g/L、酶解温度50 ℃、超声功率300 W条件下，分析超声时间分别为30、40、50、60、70、80 min时，对肉豆蔻多酚得率的影响。1.3.4.4超声功率对肉豆蔻多酚得率的影响准确称取6份1 g肉豆蔻粉末，分别置于100 mL圆底烧瓶中，在纤维素酶添加量1.5 g/L、酶解温度50 ℃、超声时间60 min条件下，分析超声功率分别为150、200、250、300、350、400 W时对肉豆蔻多酚得率的影响。1.3.5响应面因素水平设计（见表1）使用软件Design-Expert以肉豆蔻多酚得率为响应值，选择纤维素酶（A）、酶解温度（B）、超声时间（C）、超声功率（D）为考察因素，采用Box-Behnken法确定最佳工艺参数[11]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.T001表1响应面因素水平设计水平A/(g/L)B/℃C/minD/W-11.1405025001.5506030011.960703501.3.6肉豆蔻多酚体外抗氧化活性1.3.6.1肉豆蔻多酚对ABTS+·的清除能力参照谭永兰[12]的方法，略微改动。将高硫酸钾溶液（2.45 mmol/L）和等体积ABTS+溶液（7 mmol/L）混合，4 ℃冰箱中放置12 h，在734 nm处测吸光度，50%乙醇稀释，要求吸光度为（0.70±0.02）。在试管中加4.0 mL ABTS+溶液，再加入0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g/L的肉豆蔻多酚粗提液各1 mL，暗室反应，在734 nm处测吸光值，记为A1；加入50%乙醇（4.0 mL）与不同浓度肉豆蔻多酚溶液（1.0 mL）于试管中，测定吸光值，记为A2；加入4.0 mL ABTS+溶液和1.0 mL 50%乙醇，测定吸光值，记为A0，以VC作阳性对照，计算ABTS+·清除率。ABTS+·清除率=(1－A1-A2A0)×100%(2)1.3.6.2肉豆蔻多酚对DPPH·的清除能力参考孙方南等[13]的方法，稍作修改。制备浓度为0.1 g/L的DPPH溶液，在4 ℃的暗室中保存。在试管中加入2 mL质量浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g/L的多酚溶液，添加2 mL DPPH溶液，30 min后，使用无水乙醇调零，517 nm处测吸光值，记录吸光值（A1）。无水乙醇替代DPPH溶液，使用同样方法进行操作，记录吸光值（A2）。使用2 mL DPPH溶液与无水乙醇混合，30 min后，使用同样方法进行操作，记录吸光值（A0）。VC作阳性对照。DPPH·清除率=(1－A1-A2A0)×100%(3)1.4数据统计与分析采用Excel 2010和Design-Expert.V 8.0.6对上述数据进行分析和绘图。2结果与分析2.1没食子酸标准曲线（见图1）由图1可知，没食子酸标准曲线的回归方程为：y＝0.249 3x＋0.000 4，R2＝0.999 2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F001图1没食子酸标准曲线2.2单因素试验结果分析2.2.1纤维素酶添加量对肉豆蔻多酚得率的影响（见图2）由图2可知，纤维素酶添加量在0.3~1.5 g/L范围内，随着纤维素酶添加量增加，肉豆蔻多酚得率也随之升高；在纤维素酶添加量为1.5 g/L时，肉豆蔻多酚得率最大值为2.95%。在此基础上继续加大酶用量，肉豆蔻多酚得率则持续降低。原因是当加入适宜浓度的纤维素酶时，可以加快肉豆蔻溶出多酚的速度。但加入过量纤维素酶将会增加肉豆蔻溶液的黏度，阻碍溶质的溶解通道，从而降低提取的效率[14]。因此，选择纤维素酶最适宜添加量为1.5 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F002图2纤维素酶添加量对肉豆蔻多酚得率的影响2.2.2酶解温度对肉豆蔻多酚得率的影响（见图3）由图3可知，当酶解温度在20~50 ℃的范围内，肉豆蔻多酚得率持续上升。当温度到达50 ℃时，肉豆蔻多酚得率达到最大；当温度超过50 ℃时，肉豆蔻多酚得率则呈下降趋势。原因是每种酶的性质不同，且具有区别于其他酶的最佳作用温度，若低于最佳作用温度，酶活性会降低；若温度过高，酶蛋白质会发生变性，酶的活性就会减弱，从而导致多酚得率的下降。此外，部分多酚类物质也有可能会因为高温而发生氧化或者分解，这也可能是多酚得率下降的原因[15]。因此，选择最佳酶解温度为50 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F003图3酶解温度对肉豆蔻多酚得率的影响2.2.3超声时间对肉豆蔻多酚得率的影响（见图4）由图4可知，在30~60 min的范围内，肉豆蔻多酚得率迅速升高。在60 min时，肉豆蔻多酚得率最大；超过60 min后，肉豆蔻多酚得率降低。表明超声时间不适合太久，否则会导致多酚分解，从而降低多酚得率。因此，选择超声时间最佳条件为60 min进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F004图4超声时间对肉豆蔻多酚得率的影响2.2.4超声功率对肉豆蔻多酚得率的影响（见图5）由图5可知，超声功率在150~400 W范围内，肉豆蔻多酚得率呈先增大后减小的趋势。在300 W时，肉豆蔻多酚得率达到峰值，达到2.46%。超声功率超过300 W时，肉豆蔻多酚得率迅速降低。这是由于提高超声功率可以促进肉豆蔻的细胞壁损伤，从而促进多酚的溶解，但若超声功率过大，会引起体系内部的混乱，加快其他杂质的溶解，从而降低肉豆蔻多酚得率。因此，选用300 W的超声功率进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F005图5超声功率对肉豆蔻得率的影响2.3响应面试验结果分析2.3.1回归模型方差分析（见表2、表3）利用Design-Expert对试验结果进行回归拟合分析，得出纤维素酶添加量、酶解温度、超声时间、超声功率与肉豆蔻多酚得率之间的二次多元回归方程：Y=2.96+0.21A-0.11B+0.073C-0.030D-0.025AB+0.030AC-0.087AD-0.055BC+2.500×10-3BD-0.035CD-0.30A2-0.22B2-0.19C2-0.24D2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.T002表2响应曲面试验结果试验号A/(g/L)B/℃C/minD/W多酚得率/%11.550503502.3921.560703002.4531.940603002.7341.950503002.5451.560503002.4761.550703502.5571.550502502.4281.150703002.2891.550603002.97101.160603002.17111.540503002.65121.560602502.38131.550603002.99141.960603002.52151.150602502.18161.950703002.72171.140603002.28181.550603002.98191.540703002.85201.540602502.59211.150603502.31221.550702502.72231.550603002.88241.550603002.99251.950602502.82261.150503002.22271.560603502.35281.950603502.6291.540603502.55由表3可知，模型P0.000 1，表明模型显著，试验方法可行。失拟项P=0.169 8（P0.05），表明该模型拟合具有合理性[16-17]。R2 =0.962 6，R2adj=0.925 2，表明该模型与实际预测值拟合度良好，具备很高的准确度和通用性。在方程中，一次项中的A、B、C，二次项中的A2、B2、C2、D2的P值小于0.01，交互项AD的P值小于0.05，其他交互项均不显著（P0.05）。根据F值判断各因素对多酚得率影响的排序为：纤维素酶添加量＞酶解温度＞超声时间＞超声功率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.T003表3二次回归模型的方差分析项目平方和自由度均方F值P值模型1.770140.13025.730.000 1A0.52010.520105.410.0001B0.14010.14029.180.0001C0.06510.06513.170.002 7D0.01110.0112.200.159 9AB2.500×10-312.500×10-30.510.486 9AC3.600×10-313.600×10-30.730.405 9AD0.03110.0316.250.025 5BC0.01210.0122.470.138 5BD2.500×10-512.500×10-55.10×10-30.944 1CD4.900×10-314.900×10-31.000.334 4A20.58010.580118.240.000 1B20.32010.32064.880.000 1C20.23010.23046.610.000 1D20.37010.37074.750.000 1残差0.069144.902×10-3失拟项0.060105.994×10-32.760.169 8净误差8.680×10-342.170×10-3总离差1.83028注：1.P0.01表示影响极显著；P0.05表示影响显著。2.R2=0.962 6，RAdj2=0.925 2。由图6可知，图6（b）中AD的3D图坡度陡，波峰颜色深，等高线密集，呈椭圆形状。图6（a）、6（c）、6（d）中响应面较平缓，不陡峭，等高线接近圆，表明其对多酚得率无明显的影响。图6各因素交互作用对肉豆蔻多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F6a1（a）纤维素酶添加量与超声时间对肉豆蔻多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F6a2（b）纤维素酶添加量与超声功率对肉豆蔻多酚得率的影响2.3.2　各因素交互作用对肉豆蔻多酚得率的影响（见图6）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F6a3（c）酶解温度与超声时间对肉豆蔻多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F6a4（d）超声时间与超声功率对肉豆蔻多酚得率的影响2.3.3最佳工艺条件的验证结果回归模型预测的最优提取条件为：纤维素酶添加量1.59 g/L、酶解温度48.50 ℃、超声时间62.25 min、超声功率298.75 W。理论肉豆蔻多酚得率为3.018%。考虑实际操作对参数稍做调整，最终确定最佳提取条件为：纤维素酶添加量1.6 g/L、酶解温度45 ℃、超声时间60 min、超声功率300 W。在此条件下重复3次试验取平均值，获得的肉豆蔻多酚得率为2.962%，与预测值基本吻合。因此，该回归模型可用于分析超声波协同纤维素酶法提取肉豆蔻多酚的工艺。2.4肉豆蔻多酚体外抗氧化活性试验结果2.4.1肉豆蔻多酚对DPPH·的清除能力（见图7）由图7可知，在浓度1.5 g/L条件下，肉豆蔻多酚的清除率最高，为80.34%。VC溶液在浓度0.3~1.5 g/L范围内变化趋势虽与肉豆蔻多酚的一样，但其清除能力略强于肉豆蔻多酚。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F007图7不同浓度肉豆蔻多酚对DPPH自由基的清除率2.4.2肉豆蔻多酚对ABTS+·的清除能力（见图8）由图8可知，当ABTS+·浓度为0.3~0.6 g/L时，ABTS+·的清除能力随浓度的增大而明显增大。当浓度为1.5 g/L时，肉豆蔻多酚与VC的ABTS+·清除率分别为83.13%和89.47%，此时二者清除率相近。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.22.021.F008图8不同浓度肉豆蔻多酚对ABTS+自由基的清除能力3结论本试验得出最优工艺为：纤维素酶添加量1.6 g/L、酶解温度45 ℃、超声时间60 min、超声功率300 W。此条件下，肉豆蔻多酚得率为2.962%；多酚浓度为1.5 g/L时，DPPH·和ABTS+·清除率分别为80.34%和83.13%，具有较强的体外抗氧化能力。